[发明专利]基于西瓜花叶病毒保守区域的RPA检测引物、检测方法及其应用

权利要求书

1.一种基于西瓜花叶病毒保守区域的RPA检测引物，其特征在于，所述RPA检测引物包括上游引物F以及下游引物R；所述上游引物F的核苷酸序列为：5'-CTTCTATAACATGGCAATTGAAAAGGTTTACTCC-3'；所述下游引物R的核苷酸序列为：5'-CTTCAWTTCTYTTATGCATGTGYACGAACGC-3'。

2.如权利要求1所述的基于西瓜花叶病毒保守区域的RPA检测引物，其特征在于，所述RPA检测引物是基于多条西瓜花叶病毒全基因组序列比对筛选得到的保守片段设计得到的。

3.如权利要求2所述的基于西瓜花叶病毒保守区域的RPA检测引物，其特征在于，所述设计方法为：

通过对所述多条西瓜花叶病毒全基因组序列进行多序列比对鉴定筛选得到长度约300bp到500bp的保守片段；

根据所述保守片段得到所述上游引物F与所述下游引物R。

4.如权利要求3所述的基于西瓜花叶病毒保守区域的RPA检测引物，其特征在于，所述保守片段的筛选方式为：在NCBI数据库中检索获得多条西瓜花叶病毒全基因组序列，所述保守片段包含在每条西瓜花叶病毒全基因组序列中。

5.一种西瓜花叶病毒的RPA快速检测方法，其特征在于，其利用如权利要求1至4中任意一项所述的基于西瓜花叶病毒保守区域的RPA检测引物来检测待测植物中的西瓜花叶病毒，所述检测方法包括以下步骤：

RNA提取及反转录；抽提样本即所述待测植物的RNA并将其反转录成cDNA；

扩增反应：以cDNA为模板采用所述RPA检测引物进行恒温扩增反应；

判断：所述恒温扩增反应结束后判断所述待测植物的检测结果是阳性还是阴性。

6.如权利要求5所述的西瓜花叶病毒的RPA快速检测方法，其特征在于，所述恒温扩增反应的反应体系以cDNA∶RPA缓冲液∶上游引物F∶下游引物R∶荧光定量试剂∶双蒸水∶280mmol/L醋酸镁溶液按照以下比例混合：2μL∶29.5μL∶2.2μL∶2.2μL∶6.6μL∶5.0μL∶2.5μL；将所述反应体系加入到冻干酶粉中。

7.如权利要求6所述的西瓜花叶病毒的RPA快速检测方法，其特征在于，所述恒温扩增反应的扩增条件：将加有所述反应体系的冻干酶粉放入等温扩增荧光反应。

8.如权利要求7所述的西瓜花叶病毒的RPA快速检测方法，其特征在于，温扩增荧光反应的条件如下：第一步，39℃预热40s；第二步，40个循环，每个循环39℃持续30s。

9.如权利要求5所述的西瓜花叶病毒的RPA快速检测方法，其特征在于，所述恒温扩增反应结束后，如有扩增曲线出现，出峰时间≤15min，Ct值≤35，则判断为阳性；如无扩增曲线出现，出峰时间15min，Ct值35，判断为阴性。

10.一种如权利要求1所述的基于西瓜花叶病毒保守区域的RPA检测引物在制备西瓜花叶病毒检测试剂盒中的应用。