[发明专利]基于西瓜花叶病毒保守区域的RPA检测引物、检测方法及其应用

说明书

本发明公开了基于西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)保守区域的重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)检测引物、检测方法及其应用。所述RPA检测引物包括上游引物F以及下游引物R；所述上游引物F的核苷酸序列为：5'‑CTTCTATAACATGGCAATTGAAAAGGTTTACTCC‑3'；所述下游引物R的核苷酸序列为：5'‑CTTCAWTTCTYTTATGCATGTGYACGAACGC‑3'。本发明的RPA检测引物用于检测西瓜花叶病毒，灵敏度高、特异性强，能有效的控制假阴性、假阳性的出现，大大提高检测结果的准确性，可有效地筛查防控该病毒的发生危害。且本发明建立的基于西瓜花叶病毒保守区域的RPA检测方法不需要特殊仪器，检测周期短，在大豆、西瓜等植物病毒快速诊断中具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及农作物病害检测、鉴定及防治技术领域，尤其涉及一种基于西瓜花叶病毒保守区域的重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)检测引物、及基于所述RPA检测引物的西瓜花叶病毒的RPA快速检测方法、基于西瓜花叶病毒保守区域的RPA检测引物在制备西瓜花叶病毒检测试剂盒中的应用。

背景技术

大豆是世界上重要的植物油和蛋白来源，在其生长周期中，常常遭受多种病虫害的侵害。西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus,WMV)是一种对大豆危害较大的病毒性病害，严重影响大豆产量和品质。WMV侵染植株以后会导致叶片花叶、畸形、新生叶片扭曲、植株矮化及果实畸形等，造成大豆产量损失约35％-50％，甚至绝收。

WMV属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，可由叶片汁液摩擦接种传毒，也可由蚜虫传毒进行非持久传毒。目前，生产上还没有特效药防治病毒病。因此，建立高效、快速、实用的病毒检测技术，加强对WMV的监测和诊断，对西瓜花叶病毒病的防控具有重要的意义。

目前检测WMV的主要是传统的酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbentassay,ELISA)检测方法和聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)分子检测方法。传统的血清学检测假阳性率较高，PCR检测方法需要精密的多种专业仪器配合使用，且扩增时间较长。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种快速、灵敏、特异和可视化的检测技术，该技术采用4条特异引物识别靶序列上6个特异区，利用DNA链置换聚合酶在恒温条件下对靶基因扩增，具有便捷、快速、准确等优点，但LAMP对引物的条件要求较高，且在检测过程中产生易气溶胶，出现假阳性。

RPA是一项新型的等温扩增技术，其主要原理为利用重组酶和引物在模板上搜索到与之完全互补配对的序列时，在单链结合蛋白的帮助下使模板解链，引物与模板开始配对，并在聚合酶的作用下复制延伸。该方法仅需1对引物即可完成扩增，不需要复杂的引物设计过程，只需要37℃下恒温反应，不需要特殊的热循环设备，反应时间短，扩增产物有特定大小的条带，结果易于判断。RPA与荧光定量PCR技术(Quantitative real-time PCR,qPCR)相结合，通过在反应体系汇总加入特定类型的荧光染料，可以达到实时荧光检测。

WMV基因组全长10000多碱基，通过自身编码的蛋白酶切割加工，形成10个不同功能的成熟蛋白，从N端到C端依次为P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、Nib和CP。研究发现，不同地区基因组具有多样性，并且存在不同病毒种之间的基因重组。因此，通过鉴定WMV序列的保守片段，设计等温扩增引物，则会有效控制假阴性的出现，大大提高检测的准确性，能够更有效的筛查防控该病毒的发生危害。