[发明专利]一种检测5-羟甲基胞嘧啶的化学发光生物传感器及其检测方法和应用

说明书

本发明提供一种检测5‑羟甲基胞嘧啶的化学发光生物传感器及其检测方法和应用，属于分子检测技术领域。所述5‑羟甲基胞嘧啶的化学发光生物传感器包括T4噬菌体β‑葡糖基转移酶、尿苷二磷酸葡萄糖、高碘酸钠、醛基反应探针ARP、末端转移酶、氯高铁血红素和鲁米诺溶液。本发明设计的羟甲基胞嘧啶‑糖基化、高碘酸盐氧化、生物素化‑等温信号放大策略不需改变反应温度，也不需要特殊标记的核酸探针或信号扩增的特定模板，可检测基因组DNA中任意序列的5hmC，且不涉及同位素标记或特异性抗体，消除放射性危害和在基于抗体的实验中对全基因组图谱数据的错误判读。使得在有限数量的生物和临床样本中对5hmC进行全基因组分析成为可能。

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种检测5-羟甲基胞嘧啶的化学发光生物传感器及其检测方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

表观遗传修饰是指没有改变DNA序列而发生基因表达的可遗传变化。5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）是在哺乳动物基因组中发现的两个主要的表观遗传修饰。5hmC是10-11易位酶(TET)介导的5mC氧化过程中的一种氧化中间体。5hmC参与许多关键的细胞功能，包括基因调控、胚胎发育、胚胎干细胞分化、正常骨髓生成和合子发育。异常的DNA羟甲基化与各种疾病有关，是各种癌症、神经异常和危险疾病的预测性生物标志物。因此，准确检测基因组DNA中的5hmC对于疾病发生的表观遗传调控和癌症早期诊断的相关研究至关重要。

目前常用的鉴定5hmC的方法有氧化亚硫酸氢盐测序和TET辅助的亚硫酸氢盐测序。然而，发明人发现，这些以亚硫酸氢盐处理为基础的方法在酸性和热条件下由于选择性和特定环境下的DNA降解导致明显的测序偏差。另外，也有一些新的方法用于全基因组检测5hmC，如液相色谱-质谱法(LC-MS) 、薄层色谱法和免疫分析法。这些方法可以有效地区分5hmC和5mC，但它们涉及昂贵而复杂的仪器、有害的放射性底物和特异性抗体(如抗5hmC抗体和抗胞嘧啶-5-亚甲基磺酸盐抗体)，其中免疫分析的灵敏性相对较差。为了提高检测灵敏度，有的技术引入了一些扩增策略，包括硼酸介导的聚合酶链式反应(PCR)、过氧钨酸盐氧化介导的连接PCR、连接酶介导的滚环扩增。但它们不可避免地会出现非特异性扩增甚至假阳性，并且需要精心设计引物、标记的核酸探针和特异性模板。此外，这些方法仅允许对特定位置和特定片段的5hmC进行检测。因此，发展新的5hmC检测策略是非常有必要的。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种检测5-羟甲基胞嘧啶的化学发光生物传感器及其检测方法和应用。本发明设计的羟甲基胞嘧啶-糖基化、高碘酸盐氧化、生物素化-等温信号放大策略（hmC-GLIB-IAS）不需要改变反应温度，也不需要特殊标记的核酸探针或信号扩增的特定模板，可以检测基因组DNA中任意序列的5hmC，并且不涉及同位素标记或特异性抗体，消除放射性危害和在基于抗体的实验中对全基因组图谱数据的错误判读。此外，该策略无硫酸氢盐参与，它采用了酶反应和化学反应的结合，没有任何DNA降解，能够从5mC和C中分离出只有一个5hmC的DNA，使得在有限数量的生物和临床样本中对5hmC进行全基因组分析成为可能。因此具有良好的实际应用之价值。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明的第一个方面，提供一种检测5-羟甲基胞嘧啶的化学发光生物传感器，所述化学发光生物传感器至少包括：

T4噬菌体β-葡糖基转移酶（T4β-GT）、尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-Glc）、高碘酸钠、醛基反应探针ARP（Aldehyde reactive probe）、末端转移酶(TDT)、氯高铁血红素和鲁米诺溶液。

更具体的，所述化学发光生物传感器包括糖基化模块、高碘酸盐氧化模块、生物素化模块、TDT辅助等温扩增模块和化学发光检测模块。