[发明专利]一种海洋微藻脂肪酸的提取检测方法

说明书

本发明涉及微藻细胞提取检测技术领域，更具体地，涉及海洋微藻脂肪酸的提取检测方法。一种海洋微藻脂肪酸的提取检测方法，包括以下步骤：(1)(1)微藻的收集和破碎；(2)分离中性和极性脂质；(3)脂质脂肪酸分析；(4)GC‑MS分析。本发明的方法能够高效、便捷、准确的提取检测微藻脂肪酸，是研究脂肪酸组成及其代谢途径的关键一步。

技术领域

本发明涉及微藻细胞提取检测技术领域，更具体地，涉及一种海洋微藻脂肪酸的提取检测方法

背景技术

有害赤潮藻的防治及资源化是海洋生态治理和可持续发展的一个重要领域。微藻中含有丰富的脂质，它产生许多不同种类的脂质，如甘油三酸酯和甘油二酸酯，磷脂和糖脂，烃等。其中，藻类中膜结构中的磷脂占据了脂质含量的主要部分，有害藻的治理领域已经有将微藻的膜结构组成变化来衡量微藻在应对外来应激下的生理响应的一个重要指标；有报道称藻类产生的藻毒素主要为膜脂类，因此，研究藻的脂类脂肪酸构成可以作为研究藻的生物化学治理方案的一个重要指标。此外，研究藻类脂肪酸代谢对于分析和开发藻类为主的生物质能源尤为重要，区分主要脂质脂肪酸含量(极性和中性)可以了解不同的脂质对催化途径转化燃料的效率的影响。

微藻的种类繁多，目前运用在微藻的脂肪酸提取检测方法比较少，大多集中在铜绿微囊藻、小球藻和莱茵衣藻等模式藻种上，一些检测方法又存在着低效、不便捷的问题。中国专利申请，公开号为：CN101532991B公开了一种快速检测海洋微藻脂肪酸含量，该公开专利的技术方案存在着检测结果不准确的问题。

发明内容

本发明为克服上述现有技术中微藻脂肪酸的提取检测方法存在低效、不便捷，检测结果不准确的问题，提供一种海洋微藻脂肪酸的提取检测方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种海洋微藻脂肪酸的提取检测方法，包括以下步骤：

(1)微藻的收集和破碎；

取已培养好的微藻，将样品放入液氮中冷冻，解冻后对样品进行离心，离心后收集细胞，然后利用细胞破碎仪对细胞进行超声处理，取体积比为3：2至2：1的氯仿、甲醇萃取脂质，然后在室温下离心，提取疏水相为脂质提取物，在脂质提取物中加入质量比大于等于0.01％的丁基化羟基甲苯；

(2)分离中性和极性脂质

将脂质提取物蒸发至干燥并用体积比为95:5至98:2的氯仿、甲醇洗涤后回收，将脂质提取物沉积在填充硅胶的固相萃取柱上，用体积比为95:5至98:2的氯仿、甲醇洗脱中性脂质，然后用甲醇洗脱极性脂质；

(3)脂质脂肪酸分析

收集后的极性脂质和中性脂质在干燥机中干燥，在每一组分中加入甲醇和三氟化硼混合溶液作为催化剂、十九烷酸甲酯，在90-100℃下酯交换8-10min，冷却后加入正己烷，将有机相的脂肪酸甲酯用蒸馏水定容到1.5-2.0mL，回收脂肪酸甲酯后收集到气相瓶中待测；

(4)利用GC-MS对脂肪酸甲酯进行检测。

优选地，在所述步骤(1)中，取出已培养好的微藻为对数增长末期的微藻。

优选地，在气相色谱中分析FAME，GC-MS检测条件为：

GC模块：

1)柱箱温度：70℃；

2)进样口温度：260℃；

3)进样方式：不分流；

4)进样时间：1min；

5)载气：He；

6)压力：61.5Pa；

7)总流量14.0mL/min；

8)柱流量：1mL/min；