[发明专利]检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的实时荧光RAA的引物、探针、试剂盒和检测方法

权利要求书

1.一种检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的实时荧光RAA的引物和探针，其特征在于，所述引物由stx1基因和stx2基因的引物组成，所述探针由stx1探针和stx2探针组成；

stx1基因的上游引物序列：TTATCGCTTTGCTGATTTTTCACATGTTACC；SEQ ID NO.1；

stx1基因的下游引物序列：AAATCCAGATAAGAAGTAGTCAACGAATGGCG；SEQ ID NO.2；

stx1基因探针的序列为：CTGGTGACAGTAGCTATACCACGTTACAGCGT(FAM)-THF-T(BHQ1)-TGCAGGGATCAGTCG(3’blocker)；SEQ ID NO.3；

stx2基因的上游引物序列：TTTCCATGACAACGGACAGCAGTTATACCAC；SEQ ID NO.4；

stx2基因的下游引物序列：TCATTGTATTACCACTGAACTCCATTAACGC；SEQ ID NO.5；

stx2基因探针的序列为：CTGGAACGTTCCGGAATGCAAATCAGTCGT(FAM)-C-THF-C-T(BHQ1)-CACTGGTTTCATCA(3’blocker)；SEQ ID NO.6。

2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，stx1基因中上游引物为31bp，下游引物为32bp，探针为49bp，stx1基因探针共有4个修饰基团，分别为荧光基团、四氢呋喃、淬灭基团和C3-spacer，荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1，FAM和BHQ1均在T位置修饰，FAM和BHQ1中间间隔1个碱基，被四氢呋喃替换，C3-sapacer位于3’端末尾。

3.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，stx2基因中上游引物为31bp，下游引物为31bp，探针为48bp，stx2基因探针共有4个修饰基团，分别为荧光基团、四氢呋喃、淬灭基团和C3-spacer，荧光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1，FAM和BHQ1中间间隔3个碱基，中间一个碱基被四氢呋喃替换，C3-sapacer位于3’端末尾。

4.一种检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的实时荧光RAA的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的引物和探针。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括缓冲液和纯化水。

6.一种检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的实时荧光RAA的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

(1)、提取样品DNA；

(2)、以样品DNA为模板，利用试剂盒进行重组酶介导等温核酸扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测；

所述试剂盒为权利要求4所述的试剂盒。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述重组酶介导等温核酸扩增中stx1重组酶介导等温核酸扩增的反应体系为：缓冲液为25μL，上游引物为10μmol/L、2.1μL，下游引物为10μmol/L、2.1μL，探针为10μmol/L、0.6μL，纯化水为13.7μL，总体积为43.5μL；重组酶介导等温核酸扩增中stx2重组酶介导等温核酸扩增的反应体系为：缓冲液为25μL，上游引物为10μmol/L、2.1μL，下游引物为10μmol/L、2.1μL，探针为10μmol/L、0.6μL，纯化水为13.7μL，总体积为43.5μL。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述重组酶介导等温核酸扩增的反应条件为：39℃反应30min。