[发明专利]检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的实时荧光RAA的引物、探针、试剂盒和检测方法

说明书

本发明提供了一种检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的实时荧光RAA的引物、探针、试剂盒和检测方法，stx1基因的引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，stx1基因探针的序列为如SEQ ID NO.3所示；stx2基因的引物序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，stx2基因探针的序列为如SEQ ID NO.6所示；试剂盒包括引物、探针、缓冲液和纯化水；本发明的实时荧光RAA检测方法特异性达100％，灵敏度达1.6×10³cfu/mL，15min内可得到结果，比实时荧光PCR方法更快速，灵敏简便，可用于疾病监测、食品安全检测，适合基层实验室推广应用。

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的实时荧光RAA的引物、探针、试剂盒和检测方法。

背景技术

产志贺毒素大肠埃希氏菌(Shiga toxin-producing E.coli,STEC)是产志贺样毒素的大肠埃希氏菌，由于它们对猴肾细胞有毒性作用，也叫verocytotoxigenic E.coli(VTEC)。STEC是近年来最重要的新兴致病菌，可以导致腹泻、出血性结肠炎甚至溶血性尿毒综合症，是儿童急性肾衰竭的主要原因。人感染STEC主要通过摄入被污染的食物或水，直接与动物接触或通过人与人之间的传播。目前国际上STEC检测方法主要以实时荧光PCR法为主，针对两类志贺毒素基因(stx1,stx2)进行检测，然而，实时荧光PCR基于热循环仪，仪器昂贵，且对操作人员要求高，因此在基层实验室推广应用较为困难。

重组酶等温核酸扩增技术(Recombinase Aided Amplification,RAA)是新一代核酸分子检测技术，该技术利用重组酶、单链结合蛋白、DNA聚合酶在等温(37-39℃)条件下进行核酸扩增，结合荧光探针实现即时检测，是一种精准、方便和快速的核酸检测技术，实现5-15min 完成检测输出结果，比实时荧光PCR技术更快速和便捷。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的首要目的是提供一种检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的实时荧光RAA的引物和探针。

本发明的第二个目的是提供包括上述引物和探针的试剂盒。

本发明的第三个目的是提供利用上述试剂盒的RAA检测方法。

为达到上述首要目的，本发明的解决方案是：

一种检测产志贺毒素大肠埃希氏菌的实时荧光RAA的引物和探针，引物由stx1基因和stx2 基因的引物组成，探针由stx1探针和stx2探针组成；

stx1基因的上游引物序列：TTATCGCTTTGCTGATTTTTCACATGTTACC；SEQ ID NO.1；

stx1基因的下游引物序列：AAATCCAGATAAGAAGTAGTCAACGAATGGCG；SEQ ID NO.2；

stx1基因探针的序列为：CTGGTGACAGTAGCTATACCACGTTACAGCGT(FAM)-THF-T(BHQ1)-TGCAGGGATCAGTCG(3’blocker)； SEQ ID NO.3；

stx2基因的上游引物序列：TTTCCATGACAACGGACAGCAGTTATACCAC；SEQ ID NO.4；

stx2基因的下游引物序列：TCATTGTATTACCACTGAACTCCATTAACGC；SEQ ID NO.5；

stx2基因探针的序列为： CTGGAACGTTCCGGAATGCAAATCAGTCGT(FAM)-C-THF-C-T(BHQ1)-CACTGGTTTCATCA(3’blocker)； SEQ ID NO.6。