[发明专利]一种利用角质酶促进蛋白在枯草芽孢杆菌中胞外表达的方法

说明书

本发明公开了一种利用角质酶促进蛋白在枯草芽孢杆菌中胞外表达的方法，属于生物工程、酶工程、微生物工程技术领域。本发明采用角质酶突变体和目标蛋白在枯草芽孢杆菌中共表达，目标蛋白包括木糖异构酶、4,6‑α‑葡萄糖基转移酶、4‑α‑糖基转移酶、海藻糖合酶和分支酶等，可实现胞内定位目标蛋白胞外表达，提高生产效率、简化后提取工艺，具有较高的学术意义和应用价值。

技术领域

本发明涉及一种利用角质酶促进蛋白在枯草芽孢杆菌中胞外表达的方法，属于基因工程、酶工程、微生物工程技术领域。

背景技术

蛋白质的胞外表达可简化下游纯化工艺，节约成本，在大规模工业化生产中具有绝对优势。而对于天然胞内定位型蛋白，通常只能在细胞内进行表达，并且需要利用物理或化学方法对细胞进行破碎才能获得目的蛋白，后续提取工艺不但繁琐而且成本较高，因此寻找能够有效的简化下游提取步骤降低产物纯化成本成为了研究者的目标。

发明人课题组在前期研究中发现，角质酶在无信号肽介导的情况下实现了在大肠杆菌系统中高效胞外基质“分泌”型表达，尽管这种“分泌”机制还未完全解析，但是推测该现象与角质酶有限的磷脂水解活性引发的膜通透性增强有关。此外，发明人课题组还发现，当角质酶在大肠杆菌中与胞内蛋白共表达时，该效应还能够引发天然胞内定位型蛋白的胞外释放，并且在此过程中未发现明显的细胞裂解现象，因此，不会对下游分离提取过程产生明显的不利影响。当角质酶与天然胞内定位型蛋白在大肠杆菌中共表达时，角质酶能够在一定程度水解细胞膜的磷脂成分，增加细胞膜的通透性，保证细胞完整性的情况下使天然胞内定位型蛋白分泌到胞外，为重组胞内定位型酶的胞外表达提供了一种新的方向；但是大肠杆菌是非食品用菌株，其安全性不可控，因此，无法扩大其应用范围。

而枯草芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌，具备无致病性，环境兼容性好、不易产生抗药性等优点，而且还具有良好的发酵基础，其培养简单快速，已被美国食品药物管理局和中国相关部门认定为食品安全级菌株GRAS(Generally recognized as safe)，目前广泛用于生产各种工业用酶。

发明人课题组尝试将角质酶与天然胞内定位型蛋白在大肠杆菌中共表达的技术方案应用于枯草芽孢杆菌表达系统中时，由于大肠杆菌的细胞膜的组成成分与枯草芽孢杆菌细胞膜的组成成分不同，以及大肠杆菌表达系统与枯草芽孢杆菌表达系统的差异，导致天然胞内定位型蛋白的胞外分泌效果不佳，因此，如何实现天然胞内定位型蛋白胞外分泌，以及如何才能得到一种安全、高效的天然胞内定位型蛋白胞外分泌成为了亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术中采用大肠杆菌表达系统实现天然胞内定位型蛋白的胞外表达中，存在的不安全性问题，本发明为了得到一种安全、高效的天然胞内定位型蛋白胞外分泌的方法，首先提供了一种角质酶突变体，所述角质酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的角质酶的第175、177、178、207、209、213、214位中的一个或多个位点进行突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述角质酶来源于嗜热单孢菌Thermobifidafusca。

所述角质酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述角质酶突变体为，将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的角质酶的第175、177、178、207、209、213或214位的氨基酸突变为丙氨酸得到的，分别命名为：L175A、T177A、I178A、T207A、F209A、I213A、P214A。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第175位置的亮氨酸(Leu)变成丙氨酸(Ala)，同时将第177位置的苏氨酸(Thr)变成丙氨酸(Ala)，得到L175A/T177A。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将第207位置的苏氨酸(Thr)变成丙氨酸(Ala)，同时将第209位置的苯丙氨酸(Phe)变成丙氨酸(Ala)，得到T207A/F209A。