[发明专利]复合酶及其在制备麦角硫因中的应用

说明书

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及复合酶及其在制备麦角硫因中的应用。本发明提供了一种复合酶，该酶中包括L‑组氨酸甲基化酶、卤素甲基转移酶和三甲基组氨酸硫化酶。L‑组氨酸经L‑组氨酸甲基化酶、卤素甲基转移酶催化，获得三甲基组氨酸；然后经三甲基组氨酸硫化酶催化获得麦角硫因。该方法仅需两步就能实现由L‑组氨酸到麦角硫因的转化。并且，利用通过使SAM酶再生，大幅降低了SAM酶的用量。因此，该方法大幅降低了原料成本。而与此同时，该方法反应浓度高(近三十克/升)、工艺简单，具有良好的工业化生产前景。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及复合酶及其在制备麦角硫因中的应用。

背景技术

麦角硫因(L-Ergothioneine,又名thiolhistidinebetaine)是一种含硫的L-组氨酸衍生物，它广泛存在于蘑菇、黑豆、红肉和燕麦等人类日常饮食中，人体一般通过具有高度特异性的麦角硫因转运蛋白来获取并保留在体内大部分细胞和组织中。麦角硫因是一种天然抗氧化剂，能有效清除体内活性氧和氮以保护细胞免受氧化凋亡损伤；此外大量研究表明麦角硫因也可保护皮肤免受UV-辐射，可有效降低眼疾、炎症性肠病、肝纤维化等疾病；因此在日常饮食中补充麦角硫因正变成一种潜在的预防上述疾病的选择。然而高昂的价格一直极大的限制了麦角硫因的进一步推广应用，因此开发一种简易的方法能规模化生产麦角硫因变得非常重要。

麦角硫因虽然分子量不大(C₉H₁₅N₃O₂S,229.3)，但其含有的三甲基氨以及硫化的氮杂环官能团决定了该化合物功能及制备的特殊性。现今麦角硫因制备方法包含了化学合成法、发酵法以及酶催化法：

化学合成法是以L-组氨酸甲酯为起始原料，通过多次官能团选择性保护及脱保护才能间接实现氮杂环的硫化以及氨基的三甲基化(如图2所示，参考专利号:US7767826B2)，整个制备工艺非常繁琐，最终收率也低，环境成本高。

麦角硫因发酵生产研究历史悠久，如美国的Liu,pinghua通过植入Egt-1与EgtE两个麦角硫因合成基因到大肠杆菌(Escherichia coli)里，然后以L-组氨酸或三甲基组氨酸为原料发酵生产麦角硫因(参考专利：WO 2014/100752 Al)；英国的Steven A.van derHoek通过改造酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),用普通的酵母培养基发酵生产麦角硫因(参考文献：Steven A.van der Hoek et al,Front.Bioeng.Biotech.2019,7,262)，然而由于麦角硫因发酵收率低(报道所实现的最高浓度接近克级每升)，因此现今无法实现规模化生产。

麦角硫因的体外酶催化制备也有相关报道，其采用的是生物体内麦角硫因Egt系列合成酶催化(如图2所示，参考文献：Florian P.Seebeck，JACS,2010,132,6632-6633)，然由于该路线较长，EgtD酶与EgtB酶转化效率低，以及腺苷蛋氨酸用量大等原因，酶合成制备麦角硫因成本居高不下。

可见，目前仍需进一步开发低成本高收率的工业化麦角硫因生产方法。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供复合酶及其在制备麦角硫因中的应用，该方法通过两步反应即可获得麦角硫因。

本发明还提供了一种复合酶，其包括：L-组氨酸甲基化酶、卤素甲基转移酶和三甲基组氨酸硫化酶。

本发明所述的复合酶中，所述L-组氨酸甲基化酶来自Mycobacteriumsmegmatismc或Chlorobium limicola；所述卤素甲基转移酶来自Chloracidobacteriumthermophilum或Mycobacterium smegmatis；所述三甲基组氨酸硫化酶来自Escherichiacoli或Chlorobium limicola。