[发明专利]一种重组CD36蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法

权利要求书

1.一种重组CD36蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法，其特征在于：具体包括如下步骤：

步骤一、重组质粒构建：通过基因合成技术将重组CD36全长基因进行密码子优化后亚克隆到pcDNA3.1载体中，构建CD36重组质粒；

步骤二、转染：选取Expi293细胞接种三角瓶，用Opti-MENⅠ稀释准备好的无菌重组质粒，再用Opti-MENⅠ稀释准备好的ExpiFectamin 293Regent，接着将稀释后的ExpiFectamin293Regent加入至稀释后的无菌重组质粒中，对三角瓶内部的物质进行混匀后，将混合物加入至事先备好的细胞中，在培养箱中进行培养；

步骤三、收样及纯化：收集培养基，利用亲和层析技术直接对培养基进行纯化处理，首先进行琼脂糖的活化，接着进行偶联蛋白，使蛋白和活化的琼脂进行结合，对偶联蛋白进行选柱、装柱和洗柱，向偶联蛋白中缓慢加入培养基，混匀后进行洗脱处理，最后对洗出液进行吸附处理，使用碳酸氢钠和吸附物质进行中和，得到最终重组CD36蛋白；

步骤四、纯度检测：使用HPLC结束检测目的蛋白纯度，用蛋白质标样配制三组不同浓度的蛋白质溶液，接着绘制蛋白质浓度与峰高和峰面积的标准曲线，再在相同条件下测样品的峰高和峰面积，获得目标蛋白的纯度。

2.根据权利要求1所述的一种重组CD36蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法，其特征在于：所述重组CD36蛋白表达的序列：

MYRMQLLSCIALSLALVTNSGDLLIQKTIKKQVVLEEGTIAFKNWVKTGTEVYRQFWIFDVQNPQEVMMNSSNIQVKQRGPYTYRVRFLAKENVTQDAEDNTVSFLQPNGAIFEPSLSVGTEADNFTVLNLAVAAASHIYQNQFVQMILNSLINKSKSSMFQVRTLRELLWGYRDPFLSLVPYPVTTTVGLFYPYNNTADGVYKVFNGKDNISKVAIIDTYKGKRNLSYWESHCDMINGTDAASFPPFVEKSQVLQFFSSDICRSIYAVFESDVNLKGIPVYRFVLPSKAFASPVENPDNYCFCTEKIISKNCTSYGVLDISKCKEGRPVYISLPHFLYASPDVSEPIDGLNPNEEEHRTYLDIEPITGFTLQFAKRLQVNLLVKPSEKIQVLKNLKRNYIVPILWLNETGTIGDEKANMFRSQVTGKINHHHHHH*。

3.根据权利要求1所述的一种重组CD36蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法，其特征在于：所述重组质粒构建的过程中，向CD36重组质粒中添加Histag。

4.根据权利要求1所述的一种重组CD36蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法，其特征在于：所述转染的具体步骤如下：取密度为3×10⁶/mL存活率为95-99％的Expi293细胞接种三角瓶，用Opti-MENⅠ稀释准备好的无菌重组质粒，再用Opti-MENⅠ稀释准备好的ExpiFectamin 293Regent，室温静置5min，将稀释后的ExpiFectamin 293Regent加入至稀释后的无菌重组质粒中，轻柔混匀2-4次后室温静置30min，将混合物加入至事先备好的细胞中，在含8％CO₂的培养箱中在温度为37℃转速为120rpm的条件下培养4-6天。

5.根据权利要求1所述的一种重组CD36蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法，其特征在于：所述纯度检测的具体步骤如下：使用HPLC结束检测目的蛋白纯度，用蛋白质标样配制三组不同浓度的蛋白质溶液，接着绘制蛋白质浓度与峰高和峰面积相关的标准曲线，再在相同条件下测位置样品的峰高和峰面积，即可得未知样品的浓度，保证待测样品中所有组份均出峰的情况下，用目标蛋白的峰面积和峰高除以所有峰峰面积和峰高的总和即可的目标蛋白的纯度。