[发明专利]一种重组CD36蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法

说明书

本发明公开了一种重组CD36蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法，具体包括如下步骤：步骤一、重组质粒构建，步骤二、转染，步骤三、收样及纯化，步骤四、纯度检测。该重组CD36蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法，通过在构建CD36重组质粒时，添加His tag，因此简化了后期的纯化流程，一步亲和层析就能快速得到目的蛋白，整个纯化过程不足1h，全程低温操作，极大的保证了目的蛋白活性，重组质粒构建时，将密码子进行优化，使用高表达的Expi293系统对目的蛋白进行表达，优化了转染条件，极大地提高了目的蛋白的表达量，利用HPLC技术检测目的蛋白纯度，确保得到的重组CD36蛋白的纯度较高。

技术领域

本发明涉及重组CD36蛋白生产技术领域，具体为一种重组CD36蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法。

背景技术

单核细胞与内皮细胞的粘附以及单核细胞继发的浸润在动脉粥样硬化发病的早期占有着重要的地位，单核细胞在向动脉壁浸润的过程中，自身的表型及功能也发生了相应的变化，逐渐向巨噬细胞转化，并且在吞噬了大量修饰的低密度脂蛋白后转变为泡沫细胞，清道夫受体CD36抗原的表达在单核细胞转化的过程中起着非常重要的作用，CD36是体内氧化型低密度脂蛋白的重要结合受体，CD36抗原的表达增加与单核细胞向巨噬细胞分化和泡沫细胞的形成有关，单核细胞与内皮细胞的粘附接触并不仅仅是物理接触这么简单，细胞与细胞之间往往存在着交互对话，即在接触的过程中，会触发一些相应的信号传导途径，引起细胞的功能发生变化。

利用哺乳动物Expi293表达系统表达CD36蛋白并通过一步亲和层析得到最终蛋白，为后期该蛋白的活性研究奠定了基础，本发明提出了一种重组CD36蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法，有效地解决了重组CD36蛋白的活性低以及重组CD36蛋白纯度低的问题。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种重组CD36蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法，解决了重组CD36蛋白的活性低以及重组CD36蛋白纯度低的问题。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种重组CD36蛋白在哺乳动物细胞中的生产方法，具体包括如下步骤：

步骤一、重组质粒构建：通过基因合成技术将重组CD36全长基因进行密码子优化后亚克隆到pcDNA3.1载体中，构建CD36重组质粒；

步骤二、转染：选取Expi293细胞接种三角瓶，用Opti-MEN Ⅰ稀释准备好的无菌重组质粒，再用Opti-MEN Ⅰ稀释准备好的ExpiFectamin 293 Regent，接着将稀释后的ExpiFectamin 293 Regent加入至稀释后的无菌重组质粒中，对三角瓶内部的物质进行混匀后，将混合物加入至事先备好的细胞中，在培养箱中进行培养；

步骤三、收样及纯化：收集培养基，利用亲和层析技术直接对培养基进行纯化处理，首先进行琼脂糖的活化，接着进行偶联蛋白，使蛋白和活化的琼脂进行结合，对偶联蛋白进行选柱、装柱和洗柱，向偶联蛋白中缓慢加入培养基，混匀后进行洗脱处理，最后对洗出液进行吸附处理，使用碳酸氢钠和吸附物质进行中和，得到最终蛋白；

步骤四、纯度检测：使用HPLC结束检测目的蛋白纯度，用蛋白质标样配制三组不同浓度的蛋白质溶液，接着绘制蛋白质浓度与峰高和峰面积的标准曲线，再在相同条件下测样品的峰高和峰面积，获得目标蛋白的纯度。

优选的，所述重组CD36蛋白表达的序列：