[发明专利]一种定量蒿属植物花粉中nsLTP过敏原的方法

说明书

本发明公开了一种定量蒿属植物花粉中nsLTP过敏原的方法，使用双单抗夹心酶联免疫吸附实验进行定量，其中结合一抗为A2‑B8单抗，来自杭州艾乐吉生物科技有限公司，货号MA‑A2B8；检测二抗为A9‑G10单抗，来自杭州艾乐吉生物科技有限公司，货号MA‑A9G10。本发明一种定量蒿属植物花粉中nsLTP过敏原的方法具有较高的灵敏性和特异性，能够定量常见蒿属花粉中Artv 3类型过敏原。

技术领域

本发明涉及生物技术检测技术领域，特别是涉及一种定量蒿属植物花粉中nsLTP过敏原的方法。

背景技术

蒿属植物花粉是造成夏秋季节过敏性疾病的主要致敏原之一，据统计，在我国有11.3％的呼吸道过敏性疾病患者对蒿属花粉过敏，北方地区尤为严重(超过50％)。我国蒿属植物分布广泛，种类繁多，其中黄花蒿(Artemisia annua)、艾蒿(A.argyi)、大籽蒿(A.sieversiana)、茵陈蒿(A.capillaris)、野艾蒿(A.lavandulifolia)最为常见，目前用于体外诊断和免疫治疗的花粉提取物主要来自大籽蒿。

已经鉴定到的蒿花粉过敏原共7种，按照国际免疫学会联合会(I.U.I.S)下属的过敏原命名专门委员会(Allergen Nomenclature Sub-committee)(http://www.allergen.org)制定的过敏原命名规则，依次命名为Art v 1-6(来源于A.vulgaris)以及来源于黄花蒿(A.annua)的Art an 7。其中第一组分(Art v 1)和第三组分(Art v 3)是主要过敏原，Art v 1属于类防御素蛋白，被视为蒿花粉过敏的标志过敏原，超过80％的蒿过敏患者对其敏感。Art v 3属于病程相关蛋白第14家族中的非特异性脂质转移蛋白(nsLTP)，分子量大小为9KDa，主要分布在花粉壁上，在欧洲，约有70％的蒿花粉过敏患者对其敏感，而我国约有25％-66％的患者对其敏感，这种蛋白作为泛过敏原存在于很多种植物中，能够引起广泛的交叉过敏反应，尤其是与蔷薇科水果之间，诱发呼吸道、胃肠道、口腔等的过敏症状，严重影响患者的生活质量。

目前用于临床诊断和脱敏治疗的制剂主要是花粉提取物，而这些提取物由于种类和批次不同，其中所包含的过敏原有效成分差异很大，有些重要的过敏原在提取物中含量很低，用于诊疗中常出现漏检或脱敏治疗效果不显著等问题，因此，为了提高临床诊疗效率，对提取物中的主要过敏原进行定量是非常重要的。用于过敏原定量的方法包括酶联免疫吸附法(ELISA)，质谱以及其他的分子生物学手段如PCR等，其中双夹心酶联免疫吸附实验是最常用的过敏原定量方法，尤其在检测微量过敏原方面有很高的应用价值，现在已经开发出很多可以用于单一过敏原组分定量的检测试剂盒，如丹麦ALK公司开发的用于Art v1定量的单抗和多抗组合的酶联免疫(ELISA)检测试剂，桃果实中的nsLTP过敏原(Pru p 3)检测试剂等。

发明内容

本发明提供一种用于蒿花粉中Art v 3(nsLTP)类型过敏原定量的方法，该方法具有较高的灵敏性和特异性，能够定量常见蒿属花粉中Art v 3类型过敏原。

利用双单抗夹心酶联免疫吸附实验对我国主要的蒿属花粉提取物(黄花蒿、艾蒿、茵陈蒿、大籽蒿、野艾蒿、细裂叶莲蒿(A.gmelinii))中的nsLTP过敏原进行定量。

本发明包含以黄花蒿和艾蒿花粉提取物免疫小鼠，生产并筛选蒿花粉Art v 3类型过敏原的特异性单克隆抗体4种(A11-B2，A9-G10，5-E10，A2-B8)，对4种单抗的亚型和效价进行检测，然后用这4种单抗进行结合实验，筛选出与各种蒿亲和力较强的单抗(A2-B8和A9-G10)，并用这些单抗进行进一步的配对实验，筛选出用于双夹心酶联免疫吸附实验(ELISA)的最适浓度。4种单抗都来源于杭州艾乐吉生物科技有限公司，其中A11-B2单抗的货号为MA-A11B2，A9-G10单抗的货号为MA-A9G10，5-E10单抗的货号为MA-5E10，A2-B8单抗的货号为MA-A2B8。