[发明专利]一种环境样品中硅藻18SrRNA基因拷贝数绝对定量的方法

权利要求书

1.一种环境样品中硅藻18SrRNA基因拷贝数绝对定量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：DNA样品的制备，土壤或淤泥采样时通过冷冻干燥处理后，称取样品0.5g，得土壤或淤泥样品，水体采样时，采集取水样1L，用0.22μm滤膜过滤收集滤膜样品，得水样，空气沉降物采集时，将采样装置放置在户外，采样时间为15-20天，称取样品0.5g，得空气沉降物样品；

步骤2：使用DNeasy Powersoil kit对各样品进行DNA提取，记录DNA最终洗脱体积，使用Nano Drop微量紫外分光光度计检测OD260及OD280的值，得DNA样品浓度并记录，使用pH值为8.0的10mM Tris-HCl溶液将样品按比例稀释到相同的浓度；

步骤3：根据硅藻种类通用性，选定3对硅藻检测片段及特异性引物用于预实验；

步骤4：选择能够得到拷贝数浓度已知的质粒样品，通过进行Sanger测序计算得到质粒的相对分子质量，经浓度测定，即可根据根式计算得到质粒样品的拷贝数浓度；

步骤5：确定内标添加量和实验条件，将4个样品进行混样用于预实验，按照每个样品取100ngDNA混样，样品名称记为M，用于预实验的M样品DNA浓度为17.74ng/μL，共制备4份混合样品，在4份M样品中分别加入不同浓度内标设置浓度梯度，内标终浓度范围分别为：1、5、50和500pg/μl；相应内标的摩尔浓度为：0.48pM、2.40pM、2.40×101pM和2.40×102pM；

步骤6：根据样品提取的DNA浓度确定DNA上样量，引物的退火温度，预实验标准曲线中的Ct值，采用SYBRGreen法进行预实验，在96孔板中加样；样品板在荧光定量仪上进行检测，首先，95℃解链5min，再进行退火和延伸58℃，2min，共进行40个循环；

步骤7：使用Primer5软件，根据质粒序列，设计特异性引物，扩增结果经电泳确认硅藻特异性引物、内标特异性引物，扩增结果应当为单一的，长度符合预期的清晰条带，采用SYBRGreen法进行实验，每个反应做3个副孔；

步骤8：计算硅藻18SrRNA基因拷贝数；

基因测得浓度(pM)＝0.48pM×2^[-(样品测得平均Cq值-内参测得平均Cq值)]；

每单位样品量含有的基因总量(pmol/单位样品量)＝(基因测得浓度×稀释倍数×DNA体积/浓缩比)/土壤重量(或水样体积)；

每单位样品量含有的基因拷贝数(copies/单位样品量)＝6.02×10^{^23}×每单位样品量含有的基因总量/10^{^12}。

2.根据权利要求1所述的一种环境样品中硅藻18SrRNA基因拷贝数绝对定量的方法，其特征在于，所述步骤1中土壤或淤泥采样时冷阱温度在-50～-80℃。

3.根据权利要求1所述的一种环境样品中硅藻18SrRNA基因拷贝数绝对定量的方法，其特征在于，所述步骤2中DNA提取具体为：

步骤2-1：吸取1000ulCTAB裂解液至2.0mlEP管里，加入20ul溶菌酶，将适量的样品加入裂解液中，65度水浴2小时，期间颠倒混匀数次，以使样品充分裂解；

步骤2-2：离心取950ul上清，加入与上清等体积的pH值为8.0的酚、氯仿和异戊醇的混合物，酚：氯仿：异戊醇的比例为25：24：1，颠倒混匀，离心混合转速为12000rpm，混合时间为10min；

步骤2-3：取上清，加入等体积的氯仿和异戊醇，氯仿和异戊醇的比例为24:1，颠倒混匀，离心混合转速为12000rpm，混合时间为10min；

步骤2-4：吸取上清至1.5mL离心管里，加入上清液3/4体积的异丙醇，上下摇晃，在20摄氏度下进行沉淀；

步骤2-5：离心混合，混合转速为2000rpm，混合时间为10分钟，倒出液体，用1ml75％乙醇洗涤2次，剩余的少量液体可再次离心收集，然后用枪头吸出；

步骤2-6：将超净工作台吹干或室温晾干；

步骤2-7：加入51μl的ddH2O溶解DNA样品，于55～60℃下孵育10min助溶。

4.根据权利要求3所述的一种环境样品中硅藻18SrRNA基因拷贝数绝对定量的方法，其特征在于，所述步骤2-1中1000ulCTAB裂解液通过M/V为2％的CTAB，1.4MNaCl，pH值8.0的100mMTris-Cl，pH值8.0的20mMEDTA，V/V为2％的β-巯基乙醇进行混合。