[发明专利]一种环境样品中硅藻18SrRNA基因拷贝数绝对定量的方法

说明书

本发明公开了一种环境样品中硅藻18SrRNA基因拷贝数绝对定量的方法，涉及硅藻群体的特定引物绝对定量检测方法技术领域，为解决目前市面上缺少标准的目标硅藻群体的特定引物绝对定量检测方法的问题。包括以下步骤：步骤1：进行DNA样品的制备；步骤2：使用DNeasy Powersoil kit对各样品进行DNA提取，将样品按比例稀释到相同的浓度；步骤3：选定3对硅藻检测片段及特异性引物用于预实验；步骤4：选择能够得到拷贝数浓度已知的质粒样品，通过进行Sanger测序计算得到质粒的相对分子质量；步骤5：确定内标添加量和实验条件；步骤6：根据样品提取的DNA浓度确定DNA上样量，采用SYBRGreen法进行预实验；步骤7：采用SYBRGreen法进行实验；步骤8：计算硅藻18SrRNA基因拷贝数。

技术领域

本发明涉及硅藻群体的特定引物绝对定量检测方法技术领域，具体为一种环境样品中硅藻18SrRNA基因拷贝数绝对定量的方法。

背景技术

实现环境样品中硅藻的绝对定量可以帮助我们了解样品中硅藻的真实含量情况、进行不同域的微生物量的比较，从而对生态学现象做出准确的判断。当前的硅藻定量方法主要有镜检法、高通量测序法和荧光定量PCR法。

目前市面上缺少标准的目标硅藻群体的特定引物绝对定量检测方法，因此市场上急需一种环境样品中硅藻18SrRNA基因拷贝数绝对定量的方法来解决这些问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种环境样品中硅藻18SrRNA基因拷贝数绝对定量的方法，以解决上述背景技术中提出的目前市面上缺少标准的目标硅藻群体的特定引物绝对定量检测方法的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种环境样品中硅藻18SrRNA基因拷贝数绝对定量的方法，包括以下步骤：

步骤1：DNA样品的制备，土壤或淤泥采样时通过冷冻干燥处理后，称取样品0.5g，得土壤或淤泥样品，水体采样时，采集取水样1L，用0.22μm滤膜过滤收集滤膜样品，得水样，空气沉降物采集时，将采样装置放置在户外，采样时间为15-20天，称取样品0.5g，得空气沉降物样品；

步骤2：使用DNeasy Powersoil kit对各样品进行DNA提取，记录DNA最终洗脱体积，使用Nano Drop微量紫外分光光度计检测OD260及OD280的值，得DNA样品浓度并记录，使用pH值为8.0的10mM Tris-HCl溶液将样品按比例稀释到相同的浓度；

步骤3：根据硅藻种类通用性，选定3对硅藻检测片段及特异性引物用于预实验；

步骤4：选择能够得到拷贝数浓度已知的质粒样品，通过进行Sanger测序计算得到质粒的相对分子质量，经浓度测定，即可根据根式计算得到质粒样品的拷贝数浓度；

步骤5：确定内标添加量和实验条件，将4个样品进行混样用于预实验，按照每个样品取100ngDNA混样，样品名称记为M，用于预实验的M样品DNA浓度为17.74ng/μL，共制备4份混合样品，在4份M样品中分别加入不同浓度内标设置浓度梯度，内标终浓度范围分别为：1、5、50和500pg/μl；相应内标的摩尔浓度为：0.48pM、2.40pM、2.40×101pM和2.40×102pM；

步骤6：根据样品提取的DNA浓度确定DNA上样量，引物的退火温度，预实验标准曲线中的Ct值，采用SYBRGreen法进行预实验，在96孔板中加样；样品板在荧光定量仪上进行检测，首先，95℃解链5min，再进行退火和延伸58℃，2min，共进行40个循环；

步骤7：使用Primer5软件，根据质粒序列，设计特异性引物，扩增结果经电泳确认硅藻特异性引物、内标特异性引物，扩增结果应当为单一的，长度符合预期的清晰条带，采用SYBRGreen法进行实验，每个反应做3个副孔；

步骤8：计算硅藻18SrRNA基因拷贝数；