[发明专利]抗地西泮单链抗体的制备方法、产品及地西泮检测方法

权利要求书

1.一种抗地西泮单链抗体的制备方法，其特征在于，至少包括以下步骤：

S1、构建scFv基因片段：设计抗地西泮抗体的VH基因片段和VL基因片段的核苷酸序列并进行人工合成，所述VH基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述VL基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，将所述VH基因片段与所述VL基因片段扩增后连接得到所述scFv基因片段；

S2、scFv-Fc抗体的表达：将所述scFv基因片段连入含有人IgG1 Fc的pFUSE_hIgG1e5_Fc2质粒中，构建得到pFUSE_hIgG1e5_Fc2-scFv重组质粒，转染表达细胞，融和表达所述scFv-Fc抗体；

S3、纯化：收集表达细胞的上清液，纯化后，即得所述抗地西泮单链抗体。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，扩增VH基因片段的引物如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示，扩增VL基因片段的引物如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示；

通过SOE-PCR连接所述VH基因片段与所述VL基因片段，所述SOE-PCR所使用的引物序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:8所示。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在S2中，先将所述scFv基因片段扩增后再构建重组质粒，所述扩增的引物如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述表达细胞为FreeStyleTM 293F细胞。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述纯化采用Protein A亲和色谱进行纯化。

6.如权利要求1～5任一项所述的制备方法制备得到的抗地西泮单链抗体。

7.一种地西泮的检测方法，其特征在于，采用如权利要求6所述的抗地西泮单链抗体，利用ELISA法对待测样本中的地西泮进行检测。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，采用竞争性抑制ELISA法。

9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，至少包括以下步骤：

S1、包被：采用DZP-OVA包被原包被微孔板；

S2、封闭：洗涤后用BSA封闭非特异性结合位点；

S3、洗涤，加入所述抗地西泮单链抗体；

S4、用将DZP标准品稀释成梯度浓度，加入微孔板，混合后孵育；

S5、洗涤，加入HRP标记的抗人IgG1抗体，孵育；

S6、显色，测定吸光度值，绘制抗DZP scFv-Fv抗体的间接竞争ELISA标准曲线；

S7、待测样本前处理，采用S1～S6的步骤测定吸光度值，通过所述间接竞争ELISA标准曲线获得待测样本的浓度。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，在S1中，DZP-OVA包被原的浓度为2μg/mL。

11.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，

在S3中，所述抗地西泮单链抗体的稀释倍数为1：3000。

12.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，在S4中，采用10％甲醇的PBS缓冲液稀释DZP标准品。