[发明专利]抗地西泮单链抗体的制备方法、产品及地西泮检测方法

说明书

本发明涉及生物检测领域，具体讲，涉及一种抗地西泮单链抗体的制备方法、产品及地西泮的检测方法。本发明的制备方法包括构建scFv基因片段、scFv‑Fc抗体的表达和纯化。本发明制备得到的抗地西泮单链抗体相比亲代地西泮单抗隆抗体灵敏度有明显提高，并具有良好的特异性。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体讲，涉及一种抗地西泮单链抗体的制备方法、产品及地西泮检测方法。

背景技术

地西泮(Diazepam，DZP)又名安定，属苯二氮卓类药物，临床上常用治疗于失眠、惊厥、焦虑等精神疾病；小剂量短期服用通常是安全有效的，但大剂量服用可抑制中枢神经、抑制呼吸、引起中毒，长期摄入也会形成依赖性或成瘾性。虽然，我国已明令禁止在饲料和动物饮用水中使用DZP等苯二氮卓类药物，但是，由于经济利益、其高效的药物作用等原因，DZP的滥用现象依然严重。某些企业为追求高额利润，在动物饮用水、饲料中非法添加DZP，致使动物性食品中存在DZP残留；DZP与酒精等抑制类物质共同食用会提高DZP的镇静作用，提高药物吸收率；一些不法分子向酒水中添加大剂量的DZP等药物，进行性暴力、抢劫等犯罪活动，给社会的健康发展造成了极为不利的影响。因此，针对DZP残留的快速、灵敏的检测是有十分必要的，对有效监控DZP残留和维护社会治安具有积极的意义。

目前DZP的检测方法主要为色谱技术，如高效液相色谱法、气相色谱法、色谱-质谱联用法等。其所需仪器昂贵，需配有专业操作人员，样品前处理繁琐，难以得到普及，不适用于基层和现场的检测。而免疫技术因其灵敏性好、特异性高、成本低、检测快速等优势一直备受亲睐，其中酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是最为常用的检测方法。由于某些精神类药物的抗体很难制备，目前针对DZP的单克隆抗体和多克隆抗体的研究并不多见，在一定程度上限制了ELISA技术的广泛应用。而利用基因工程技术制备的重组抗体，既保留了天然抗体的生物学活性和特异性，又具有经济性好的优势，成为研究者的关注热点。

1988年由Bird和Huston最先成功获得的单链抗体(single chain fragmentviarable，scFv)，是一种利用基因工程技术将传统抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一段约5～25个氨基酸连接肽首尾拼接而成的重组抗体。因其具有分子量小、特异性高、易改造等优势，被广泛应用于生物技术和临床医药等领域。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的首要发明目的在于提供一种抗地西泮单链抗体的制备方法。

本发明的第二发明目的在于提供该方法制备得到的抗地西泮单链抗体。

本发明的第三发明目的在于提供一种地西泮检测方法。

为了完成本发明的发明目的，采用的技术方案为：

本发明提出一种抗地西泮单链抗体的制备方法，至少包括以下步骤：

S1、构建scFv基因片段：设计抗地西泮抗体的VH基因片段和VL基因片段的核苷酸序列并进行人工合成，所述VH基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述VL基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，将所述VH基因片段与所述VL基因片段扩增后连接得到所述scFv基因片段；

S2、scFv-Fc抗体的表达：将所述scFv基因片段连入含有人IgG1 Fc的pFUSE_hIgG1e5_Fc2质粒中，构建得到pFUSE_hIgG1e5_Fc2-scFv重组质粒，转染表达细胞，融和表达所述scFv-Fc抗体；

S3、纯化：收集表达细胞的上清液，纯化后，即得所述抗地西泮单链抗体。

可选的，扩增VH基因片段的引物如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示，扩增VL基因片段的引物如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示；