[发明专利]一种支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的合成方法及其应用

权利要求书

1.一种支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的合成方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）恩诺沙星的活化：按摩尔比0.03:（0.09-0.1）:（0.09-0.1）将恩诺沙星、NHS和EDC溶解在0.01-0.05wt%的NaOH水溶液和DMF体积比为1:（3-5）的混合液中进行活化反应，得到活化的恩诺沙星；

2）偶联：将活化的恩诺沙星加入到Mw=20000-30000的支化聚乙烯亚胺水溶液中，将所得混合溶液振荡处理以进行偶联反应；

3）透析：将步骤2）所得偶联产物在水中透析处理以除去未反应的恩诺沙星，将所透析所得复合物进行冻干处理，得到支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星，即ENR-PEI。

2.如权利要求1所述的合成方法，其特征在于，

步骤1）中：

恩诺沙星、NHS和EDC的总质量与混合液的固液比范围为5-10mg/mL；

活化反应条件为：在15-25℃下，摇床80-110 r/min振荡20-30h；

步骤2）中：

所述聚乙烯亚胺水溶液的浓度为4-6mg/mL；

偶联反应条件为1-6℃，反应时间10-15 h；

步骤3）中：透析条件为：1-6℃，2-4天。

3.一种以权利要求1或2所述合成方法所得的支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星在特异性抗体纯化中的用途，其特征在于，所述支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的偶联比为45-55。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于：将支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星即ENR-PEI连接到溴化氰活化的琼脂糖凝胶上，制备抗体纯化柱，对多克隆抗体进行纯化，获得特异性抗体。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于包括如下步骤：

a）将溴化氰活化的琼脂糖凝胶在HCl溶液中分散活化，利用偶联缓冲液A将ENR-PEI与溴化氰活化的琼脂糖凝胶偶联，未结合的ENR-PEI 通过偶联缓冲液A洗去，用Tris-HCl溶液封闭未反应的位点，洗掉Tris-HCl溶液并用PBS溶液洗涤，将所得产物制备为抗体纯化柱；

b）血清采用偶联缓冲液B稀释，加到柱床，并用洗杂液A和洗杂液B洗涤杂蛋白，用Gly-HCl洗脱特异性抗体。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于：

步骤a）中：

所述溴化氰活化的琼脂糖凝胶与ENR-PEI的质量比为1:（0.020-0.025）；

偶联反应条件为：室温，10-20 r/min，4-8 h；

所述HCl溶液的浓度为0.8-1.2 mmol/L；所述偶联缓冲液A的pH=7.0-7.5；所述Tris-HCl溶液的pH=7.8-8.2；

步骤b）中：

所述偶联缓冲液B的pH=6.8-7.2，稀释倍数为8-12倍；

所述洗杂液A的pH=3.8-4.2；洗杂液B的pH=7.8-8.2；所述Gly-HCl的pH=2.3-2.7。

7.一种以权利要求1或2所述合成方法所得的支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星在竞争ELISA检测中作为包被抗原的用途，其特征在于，所述支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的偶联比为7-10。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于包括以下步骤：

A）将支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星即ENR-PEI配制为水溶液后作为包被抗原溶液；

B）将恩诺沙星溶解于NaOH水溶液中作为储备液，分别用PBS梯度稀释为多个梯度浓度；

C）将包被抗原溶液加入到96孔板中，包被过夜；

D）用PBST洗板，采用脱脂奶粉溶液封闭，用PBST洗板；将梯度稀释的恩诺沙星溶液与等体积的抗体混合，并采用稀释抗体作为阳性对照；加入到包被孔中，孵育；

E）用PBST洗涤后，加入山羊抗兔IgG/HRP抗体孵育；

F）洗板后，加入TMB单组分显色液，孵育后，立即添加硫酸终止液终止反应，读取吸光值。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于：

步骤A）具体为：将支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星即ENR-PEI配制为0.8-1.2mg/mL的水溶液，将其用PBS稀释至8-12 μg/mL作为包被抗原溶液；和/或

步骤B）中：所述的NaOH水溶液的浓度为0.01-0.05wt%；各梯度稀释浓度为2 ppm，1ppm，400 ppb，200 ppb，100 ppb，40ppb，10 ppb；和/或

步骤C）中：包被抗原溶液的加入量为90-110 µL，包被温度为1-5℃；和/或

步骤D）中：脱脂奶粉溶液的浓度为3-7wt%，封闭温度为30-40℃，封闭时间为1-3h；所述等体积的抗体的稀释倍数为2000-3000倍，作为阳性对照的所述稀释抗体的稀释倍数为4000-6000倍；孵育温度为30-40°C，孵育时间为1-2h；和/或

步骤E）中，所述山羊抗兔IgG/HRP抗体的稀释倍数为4000-5000倍，加入量为90-110μL，孵育时间为0.5-1.5h；和/或

步骤F）中，TMB单组分显色液的加入量为90-110 µL，孵育温度为30-40°C，孵育时间为3-7min，添加40-60 µL、1.5-2.5 mol/L的硫酸终止液终止反应，用酶标仪在440-460 nm处读取吸光值。