[发明专利]一种支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的合成方法及其应用

说明书

本发明涉及分离纯化及检测技术领域，公开了一种支化聚乙烯亚胺‑恩诺沙星的合成方法及其应用，本发明利用支化聚乙烯亚胺分子上丰富的氨基量，通过EDC/NHS反应，将恩诺沙星连接到支化聚乙烯亚胺上，可根据不同偶联比该复合物分别应用于特异性抗体纯化以及作为包被抗原用于ELISA检测中。本发明方法的合成过程简单，可在较为粗糙的条件下进行，反应失败率几乎为零，所得复合物稳定性好。通过纯化抗体以及用于ELISA检测中，检测的灵敏度可提高10倍以上，有潜力作为新型材料克服免疫检测中的弊端，推广使用。

技术领域

本发明涉及分离纯化及检测技术领域，尤其涉及一种支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的合成方法及其应用。

背景技术

小分子危害物，例如农兽药残留等，是目前影响食品安全的重要因素，引起了广泛的关注和重视。欧盟和中国等很多国家，针对目前小分子药物的应用现状制订了更为严格的限量标准，甚至很多危害物质要求不能检出。因此，亟需建立快速、简单、高通量、低成本的筛查食品中农兽药残留等危害物质的检测技术。

目前，ELISA免疫检测具有操作简单、灵敏度高、选择性强等特点，被广泛应用于农药和兽药残留的高通量分析和筛查。但是，ELISA检测中存在的多种问题，显著制约了其发展。尤其是多克隆抗体，在检测过程中，出现的假阳性，假阴性，高效价无竞争的情况，及检测灵敏度低等情况，是制约其发展的关键因素。而影响检测灵敏度的两大关键因素为抗体的质量以及ELISA的包被抗原有无非特异性结合。

在多克隆抗体中，特异性抗体的比例仅在10%-20%之间，其余大量的非特异性抗体严重影响检测的灵敏度。而能否排除非特异性抗体的影响成为检测成功的关键。

在目前的ELISA检测中，主流的包被抗原依然是采用BSA或者OVA作为载体，连接小分子物质，制备包被抗原，在偶联过程中，由于蛋白在DMF中易变性，偶联效率较低，最终产物得率较低，同时偶联比难以控制，且高纯度蛋白载体价格较为昂贵，其对于蛋白载体来讲，抗体对于载体蛋白的非特异性结合，是引起ELISA检测结果不稳定，灵敏度低，竞争有效价无有效竞争的关键原因。

此外，在抗体纯化的过程中，由于特异性抗体属于痕量水平，很难从复杂的血清基质中获得，现有的大多数纯化抗体的方法只能区分抗体成分和非抗体成分，无法区分非特异性抗体和特异性抗体。

因此，亟需开发一种新型的载体材料，具有性质稳定，价格低廉，容易合成加工，可以用于纯化抗体和免疫检测中，获得高质量抗体，同时提高检测灵敏度及准确率，对于小分子危害物的检测至关重要。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的合成方法及其应用，本发明方法的合成过程简单，可在较为粗糙的条件下进行，反应失败率几乎为零，所得复合物稳定性好；且偶联比可控，可通过调整小分子恩诺沙星的偶联比分情况用于特异性抗体纯化以及替代蛋白作为ELISA检测的包被抗原ELISA检测中。通过纯化抗体以及用于ELISA检测中，检测的灵敏度提高了10倍以上，有潜力作为新型材料克服免疫检测中的弊端，推广使用。

本发明的具体技术方案为：

第一方面，本发明提供了一种支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星的合成方法，利用支化聚乙烯亚胺上丰富的氨基，通过EDC/NHS反应将恩诺沙星接枝到支化聚乙烯亚胺上，得到支化聚乙烯亚胺-恩诺沙星。

作为优选，所述合成方法包括以下步骤：

1）恩诺沙星的活化：按摩尔比0.03:（0.09-0.1）:（0.09-0.1）将恩诺沙星、NHS和EDC溶解在NaOH水溶液和DMF的混合液中进行活化反应，得到活化的恩诺沙星。

2）偶联：将活化的恩诺沙星加入到Mw=20000-30000的支化聚乙烯亚胺水溶液中，将所得混合溶液振荡处理以进行偶联反应。