[发明专利]一种基于报告基因方法检测PVRIG抗体的生物学活性的方法

说明书

本发明公开了一种基于报告基因方法检测PVRIG抗体的生物学活性的方法，本方法基于荧光素酶报告基因法，通过对PVRIG/PVRL2信号通路的分析，建立了一种抗PVRIG单克隆抗体的功能活性检测方法，可以用于抗PVRIG单克隆抗体的快速评价和大规模筛选。本方法的准确度和精确度高，而且特异性较强，可用于检测抗PVRIG单克隆抗体到的生物活性，以实现对该靶点药物的快速评价和大规模筛选。

技术领域

本申请涉及生物药活性检测领域。更具体地，本申请涉及一种基于报告基因方法检测PVRIG抗体的生物学活性的方法。

背景技术

在肿瘤微环境中，肿瘤抗原的持续刺激能够引起T细胞耗竭，即T细胞失活的状态，共抑制分子诸如PD-1、LAG-3、TIM-3以及TIGIT的表达会上调。目前，靶向这些免疫检查点抑制剂的治疗方法正广泛用于肿瘤的治疗中。

脊髓灰质炎病毒受体相关免疫球蛋白结构域（PVRIG，又被称为CD112R）是一个新兴的共抑制免疫检查点蛋白，在逆转细胞耗竭和增强NK细胞活化中起着重要的作用。PVRIG属于nectin和nectin样家族，家族成员还包括TIGIT、DNAM-1（又名CD226）和CD96。PVRIG在NK和T细胞表面有表达，在激活的T细胞表面表达会进一步上调。PVRIG的配体PVRL2（又名CD112）表达于抗原递呈细胞和多种肿瘤细胞的表面，结合PVRIG后引起T细胞和NK细胞活化的抑制。PVRL2同时也是CD226的配体，后者可以激活T细胞和NK细胞。与CD226相比，PVRL2与PVRIG具有更高的亲和力，所以在正常情况下，PVRL2主要通过结合PVRIG从而抑制NK和T细胞的活化。通过抗PVRIG的单克隆抗体阻断PVRIG/PVRL2信号通路，恢复T细胞和NK细胞的免疫杀伤功能，能够发挥良好的治疗效果，具有很好的临床应用前景。

目前应用于免疫检查点抑制剂的抗体药物活性的传统检测方法具有许多缺点。例如，基于蛋白水平或细胞水平的竞争实验，可以通过受体和配体之间的结合检测抗体的阻断能力。这种方法虽适用于大规模筛选，但其主要缺点是并不能检测受体下游的信号通路的变化，并不能真正反映抗体的活性。例如，利用新鲜分离的外周血单个核细胞（PBMC）检测免疫检查点抑制剂对细胞增殖以及细胞因子分泌的影响。这种分析方法的主要缺点是实验材料难以获得，而且分离PBMC的实验操作复杂，实验周期至少需要3到5天，时间成本和人力成本较高。更重要的是，由于不同献血者之间PBMC的差异，实验结果很容易产生较大的差异，影响实验人员对结果的判断。因此，需要针对PVRIG阻断性抗体开发更有效且更适合大规模筛选的活性检测方法。

靶向PVRIG通路的抗体目前并没有一种很好的适用于大规模筛选的抗体活性检测方法。因此，提供一种高通量的方法来检测抗PVRIG单克隆抗体的阻断活性是很有必要的。近些年，报告基因方法由于其高效的实验过程及准确的实验结果已被细胞生物学广泛使用以研究基因表达及其它与基因表达相关的细胞学事件。萤火虫荧光素酶是一个61kDa的单体蛋白，以ATP•Mg2+为共同底物催化荧光素的氧化反应。在形成氧化荧光素过程中，通过电子转移将化学能转化为光能，具有检测速度快、灵敏度高、稳定性好、线性范围广等优点。

PVRIG作为一个新兴的免疫检查点，与其配体PVRL2结合后抑制T细胞活化的方式类似于PD-L1与PD-1结合后对T细胞的抑制作用。利用荧光素酶报告基因方法所构建的细胞筛选模型，建立抗PVRIG单克隆抗体的生物活性测定方法，从而对其进行评价和筛选，可以作为此类药物早期研发过程中的一种有效措施。

本发明通过将人PVRIG全长基因片段与NFAT-RE-luc2P基因片段共同连入同一个载体，实现PVRIG蛋白和荧光素酶蛋白的共同表达，解决了不同基因由不同启动子控制导致二者表达量不一致而影响实验结果的问题。同时，通过构建人工抗原递呈细胞避免了在实验体系中需要额外加入抗CD3抗体的问题，从而使实验体系更简单，而且T细胞的激活情况更接近于天然状态。

发明内容