[发明专利]一种鉴定完整糖肽上N-连接糖链类型的方法

说明书

本发明提供了一种鉴定完整糖肽上N‑连接糖链类型的方法。该方法包括以下步骤：(1)获取串联质谱数据；(2)确定二级质谱谱图中所有谱峰(多肽碎片、糖链碎片)的分子质量；(3)确定多肽分子质量和多肽的准确序列；(4)基于多肽分子质量，搜索相应的多肽+糖链的分子质量；根据分子质量确定多肽+五糖核心结构是否存在特定修饰，确定m＝peptide+HexNAc*2+Hex*3或增加特定修饰的质量；(5)通过判断二级质谱谱图中是否存在m+Hex、m+Hex*2、m+HexNAc、m+HexNAc+Hex谱峰来判断糖链类型。本发明能够实现对N‑连接糖链类型的规模化的准确判断。

技术领域

本申请主要涉及一种鉴定糖蛋白上N-连接糖链类型的方法。

背景技术

糖基化是蛋白质最常见的翻译后修饰之一，包括N-连接和O-连接糖基化修饰。已知N-连接糖链广泛存在于各种生物中，具有重要的生物学意义，其主要修饰在氨基酸保守序列上，即N-X-S/T(其中X为除了脯氨酸之外的任意氨基酸)。N-连接糖链具有相似的核心结构，根据核心结构之外分支结构的不同将N-连接糖链分成三种不同的类型：高甘露糖型(High mannose)、复杂型(Complex)和杂合型(Hybrid)。高甘露糖指核心结构之外，仅包含甘露糖；复杂型糖指在核心结构之外的分支结构都以N-乙酰葡糖胺(HexNAc)开始延伸；杂合型糖指核心结构之外的分支分别以N-乙酰葡糖胺和甘露糖开始延伸。高甘露糖修饰的糖蛋白主要位于内质网和高尔基体上，辅助其他蛋白质在合成过程中的正确折叠。而杂合型和复杂型糖结构相对比较复杂，其中任何单糖的改变都可能会影响相应蛋白的生物学功能。而N-连接糖链类型的区分是对糖链结构判断的重要一环。同时，对N-连接糖链类型的区分有助于我们进一步深入研究其生物学功能。

质谱技术是规模化鉴定蛋白质糖基化修饰的重要手段，首先通过识别质谱谱图中的特征性的氧鎓离子鉴别完整糖肽谱图，然后采用数据库匹配或者从头测序的的方式，分别对糖肽中的多肽和糖链部分进行鉴定。目前已有多种规模化鉴定完整糖肽的软件，其中经典软件包括Byonic^[1]，GPQuest^[2]，pGlyco 2.0^[3]等。但是以上软件均只能实现对糖链组成的鉴定，对于糖链类型的判定是基于糖链组成进行推测，并没有实现对糖链类型的准确判定。根据组成，通常会认为仅含有两个N-乙酰己糖胺的N-连键糖链为高甘露糖型；含有三个N-乙酰己糖胺为杂合型；含有四个及以上N-乙酰己糖胺为复杂型。但是仅通过统计N-乙酰己糖胺的个数来粗略判断糖链类型的方法是不正确的，存在很多的错误判断。例如，HexNAc4Hex5通过统计HexNAc个数会认为该糖链为复杂型糖，但是实际情况下该糖链也是有可能为杂合型(图1)。而错误判断糖链类型会误导对其修饰蛋白生物学功能的研究。

因此，准确判断N-糖链的类型对于糖链结构的整体鉴定至关重要。

参考文献：

[1]Bern M,Kil YJ,Becker C.Byonic:advanced Peptide and proteinidentification software[J].Current Protocols in Bioinformatics 2012:13.20.11-13.20.14.

[2]Toghi Eshghi S,Shah P,Yang W,et al.GPQuest:A Spectral LibraryMatching Algorithm for Site-Specific Assignment of Tandem Mass Spectra toIntact N-glycopeptides[J].Analytical Chemistry 2015,87(10):5181-5188.