[发明专利]一种检测食品样品中的黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A的方法

说明书

本发明提供了一种简单，快速、信号增强的双DNA镊子纳米机器，用于一步同时检测食品样品中的黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A。当双DNA镊子被霉菌毒素的适体锁定时，荧光信号“关闭”。在存在黄曲霉毒素B1或赭曲霉毒素A的情况下，适体可以与其相应的靶标结合，从而导致DNA镊子的“打开”和荧光信号的“开启”。黄曲霉毒素B1的检出限为3.5×10^‑2ng/mL，赭曲霉毒素A的检出限为0.1ng/mL。而且，它对同时检测黄曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A具有很高的灵敏度和特异性。该方法在食品安全筛查和内部诊断方面具有巨大潜力。

技术领域

本发明涉及食品样品中的霉菌毒素的检测领域，特别是基于双DNA镊子纳米机器的霉菌毒素的检测方法领域。

背景技术

霉菌毒素是真菌产生的具有不同结构和毒性作用的次生代谢产物，主要属于曲霉属，青霉属和镰刀菌属。霉菌毒素的分子量低，分子结构的多样性高，即使在低浓度下也能在人类和动物中引起一系列生物学效应。在约600种真菌代谢物中，只有极少数霉菌毒素包括黄曲霉毒素B1(AFB1)和赭曲霉毒素A(OTA)对人类和动物构成严重威胁。AFB1由真菌黄曲霉和曲霉生长期间产生。国际癌症研究机构(IARC)已将其归类为第一类致癌物。欧盟和各种政府机构为食品安全和公共卫生制定了人类食品和动物饲料中AFB1的最大残留量(MRL)。AFB1和黄曲霉毒素的总限量分别设置为5μg/kg和10μg/kg。OTA被认为是最潜在的肾致癌物之一，它是最常见的自然产生的真菌毒素，主要由曲霉和绿霉菌产生。OTA对实验室和农场动物具有肾毒性，肝毒性，免疫毒性和胚胎毒性。IARC将其归类为2B类可能是人类致癌物。自2012年1月7日以来，某些香料中OTA的最大残留限量已从30μg kg-1降至15μg kg-1。

已经开发出许多测定AFB1和OTA的方法。基于色谱和免疫分析的方法是官方实验室中常规真菌毒素分析的最常见商业方法。这些方法显示出对霉菌毒素检测的高灵敏度和选择性。但是，色谱法受限于昂贵的仪器，经验丰富的操作员和繁琐的预处理。另外，免疫测定法在运输和储存中遭受抗体的稳定性的困扰。因此，迫切需要开发一种简单而灵敏的方法来现场和实时检测AFB1和OTA。

适体是从“通过指数富集的配体的系统进化(SELEX)”获得的单条核酸，能够紧密结合并选择性地靶向天然抗体。它已被用作传感器设计中理想的组件，用于检测蛋白质，肽，小分子和细胞。DNA镊子是一种由DNA编程和构建的纳米结构。它可以实现纳米尺度的纳米机械运动。DNA镊子由于其简单的结构和直接的响应机制而在传感器设计中具有独特的优势。它显示了可感知核酸，金属离子，蛋白质，酶和pH值的纳米级可控性和生物相容性。但是，尚未有DNA镊子用于霉菌毒素检测。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种基于双DNA镊子纳米机器同时检测AFB1和OTA的检测方法。

本发明包括如下步骤：

(1)双DNA镊子纳米机的制备

在10mM Tris-HCl缓冲液中以1：1的摩尔比制备序列为1-6的双DNA镊子纳米机，其中，DNA序列1-6 5’-3’为：

1：FAM-TATATA-GTCCTATCTATGATGGCCCCTTTGTAGACTCAGGAT-AATATT-BHQ3。

2：Cy5-TGCCCA-ATGACACATCACTAGGCCCCGTTGGAGCGACATTAG-TCCGAT-DABCYL

3：CTAATGTCGCTCCAACAACCATCATAGATAGGAC

4：ATCCTGAGTCTACAAATACCTAGTGATGTGTCAT

5：GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-TATATA