[发明专利]一株铜绿假单胞菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一株铜绿假单胞菌及其构建方法与应用。本发明公开一株铜绿假单胞菌重组菌，其过表达NAD+合成酶。本发明为微生物利用甘油发酵生产鼠李糖脂提供了新的开发策略。

技术领域

本发明属于基因技术领域，涉及一株铜绿假单胞菌及其构建方法与应用。

背景技术

鼠李糖脂是由假单胞菌产生的一种糖脂类的阴离子表面活性剂，它具有和化学表面活性剂相同的乳化、润湿、发泡等性能，同时兼具健康无毒、绿色环保等特性，是目前研究最成熟，最深入的生物表面活性剂之一。在石油开采、污水污泥治理、土壤修复、农业生产、日用洗涤产品、化妆品、食品医药等领域均具有广泛的应用。

NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，在维持细胞生长、分化和能量代谢以及细胞保护方面起着重要作用，而调节微生物胞内NADH的浓度，可以定向的提高微生物细胞整体代谢水平，增加对碳源的消耗，实现发酵产能的提高。

CN201510100736.0孙叶芳等人通过过表达鼠李糖脂合成酶RhlAB，鼠李糖脂产量提高接近10倍，CN201711021178.4朱坤等人通过分子手段降低铜绿假单胞菌多糖合成，提高鼠李糖脂合成水平，最终鼠李糖脂产量提高93％。目前尚无铜绿假单胞菌中nadE基因与鼠李糖脂生产相关性的研究。

发明内容

本发明的目的是通过在铜绿假单胞菌中过量表达NAD+合成酶基因nadE，以提高鼠李糖脂的产量。

在一个方面，本发明提供一株铜绿假单胞菌重组菌，其过表达NAD+合成酶；相对于出发菌株，所述铜绿假单胞菌重组菌能提高鼠李糖脂的产量。

在一些实施方案中，上述铜绿假单胞菌重组菌中，所述NAD+合成酶为如下a)或b)所示的蛋白质：

a)SEQ ID NO:4所示的蛋白质；

b)将SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质；

所述b)中的蛋白质的编码基因可通过将SEQ ID NO:3所示的DNA序列缺失或添加一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。

在一些实施方案中，上述任一所述的铜绿假单胞菌重组菌中，所述过表达NAD+合成酶是通过在出发菌株中过表达nadE基因实现的；

优选地，所述nadE基因为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)SEQ ID NO:3所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码上述任一所述的NAD+合成酶的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码上述任一所述的NAD+合成酶的DNA分子；

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码NAD+合成酶的核苷酸序列进行突变；那些经过人工修饰的，具有与本发明的编码NAD+合成酶的核苷酸序列有一定同一性的核苷酸，只要编码NAD+合成酶且具有NAD+合成酶的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与核酸序列的序列相似性。“同一性”可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

在一些实施方案中，上述铜绿假单胞菌重组菌中，所述出发菌株为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)KT1115，其保藏编号为CCTCC M2016686。

在第二个方面，本发明提供上述任一所述的铜绿假单胞菌重组菌的构建方法，包括在出发菌株中过表达NAD+合成酶。