[发明专利]一种端粒相对长度检测试剂盒

说明书

本发明涉及一种端粒相对长度检测试剂盒。所述试剂盒包括：端粒基因引物序列，如SEQ ID NO.1‑2所示；内参基因引物序列，如SEQ ID NO.3‑4所示；探针序列，如SEQ ID NO.5所示；内参基因：多拷贝序列作为内参基因序列；标准品：永生化细胞系DNA。该试剂盒进行端粒长度检测效果稳定，原料廉价易得，实验操作简单、易行。

技术领域

本发明属于分子生物学和医学检测技术领域，特别涉及一种端粒相对长度检测试剂盒。

背景技术

端粒是真核染色体末端的特殊末端封端结构，由TTAGGG重复序列和多种蛋白(如庇护素和端粒酶)组成。端粒可确保染色体稳定性，并保护末端免于降解以及与其他染色体融合。由于DNA聚合酶不能将DNA复制到线性染色体的末端，它们起到防止DNA复制过程中重要遗传信息丢失的保护作用。

真核端粒通常以3'单链DNA突出端终止，这对于端粒的维持和加帽至关重要。该3'单链重复DNA回环并退火为双链，形成一个大的物理环结构，称为端粒环(T环)。T环可能提供一种掩盖端粒末端免受细胞活动的一般机制，而细胞活动可以作用于DNA末端并调节端粒的延长和缩短。在T环结构中，在与C链配对并置换G链的基础上，提出了3'突出端侵入双链端粒DNA，形成D环(置换环)。链侵入发生在距端粒物理末端一定距离的地方，因此导致大的T环结构。

目前，常用的端粒长度检测方法主要包括：端粒末端限制性片段分析(TRF)、荧光定量PCR(qPCR)、定量荧光原位杂交(Q-FISH)、流式荧光原位杂交(Flow-FISH)等。其中，TRF方法通过限制性内切酶消化基因组DNA而端粒片段不会被切割，消化产物通过Southernblotting方法检测端粒长度。虽然TRF分析被视为TL测量的“黄金标准”，可测量端粒涂片的强度，从而通常确定平均TL，可以在Southern印迹上成像各种端粒大小，但最短的端粒无法显示。Q-FISH与FLOW FISH均采用荧光标记探针(CCCTAA)3与细胞悬液杂交，通过检测端粒荧光信号进行端粒长度分析。其中，FLOW-FISH技术通过流式细胞仪进行端粒荧光信号分析，能精确获得每个细胞的平均端粒长度，敏感性、重复性较好。但是，由于探针杂交的限制，Q-FISH方法无法在端粒重复低于PNA探针杂交阈值的染色体末端的端粒上检测荧光信号(所谓的无端粒末端)。所有Q-FISH技术的另一个缺点是，该探针还可能与一些间质端粒序列(ITS)结合，该序列由脊椎动物中远离染色体末端的端粒重复序列组成，从而产生一定的假阳性结果。也有人担心某些非常明亮的Q-FISH信号可能代表非常接近的几个端粒的簇，并且不知道它们如何在定量分析中反映出来。

qPCR方法因具备DNA用量少，操作简单、仪器设备易得等优点，特别适用于端粒长度的检测分析。现有的qPCR方法通过设计引物，扩增端粒基因片段与内参基因片段，通过T/S比值来计算端粒相对长度。实验中，由于不同人员、或使用不同批次试剂进行操作，会造成检测结果的批间差异，很难做到对端粒长度的持续动态监测与准确对比分析。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种端粒相对长度检测试剂盒，以克服现有技术中对端粒长度检测准确性不高等缺陷。

本发明提供一种端粒相对长度检测试剂盒，所述试剂盒包括：

端粒基因引物序列，如SEQ ID NO.1-2所示：

正向引物：GTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT，

反向引物：GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT；

内参基因引物序列，如SEQ ID NO.3-4所示，所述内参基因为YH-1：

正向引物：CGCACAGAGTAGTAAG-GAAAGTGAAGTAGGCCGGGC，

反向引物：GTGCTGGGATTACAGGCGTGAG；