[发明专利]生产3-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用

权利要求书

1.生产3-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述重组枯草芽孢杆菌为重组枯草芽孢杆菌1643FL、重组枯草芽孢杆菌1643FL-fcoA2、或者重组枯草芽孢杆菌1643FL-fcoA1；

所述重组枯草芽孢杆菌1643FL通过在枯草芽孢杆菌的manA位点整合编码甘露糖6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶的融合基因片段，以及在xylA-xylB位点整合编码GDP-甘露糖脱水酶、GDP-L-岩藻糖合成酶、α-1,3岩藻糖基转移酶的融合基因片段获得；所述编码甘露糖6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶的融合基因片段为SEQ ID NO：1所示的序列；所述编码GDP-甘露糖脱水酶、GDP-L-岩藻糖合成酶、α-1,3岩藻糖基转移酶的融合基因片段为SEQ ID NO：2所示的序列；

所述重组枯草芽孢杆菌1643FL-fcoA2通过如下方法构建：

构建fcoA2-PxylA-lacY，它由5个片断U-fcoA2、Cmg、PxylA、lacYg和D-fcoA2构成；U-fcoA2和D-fcoA2分别以枯草芽孢杆菌ATCC 6051a基因组为模板扩增而来；lacYg以大肠杆菌BL21（DE3）为模板；PxylA和Cmg由人工合成片断为模板扩增；其中，PCR扩增的引物序列如下：扩增U-fcoA2的F端引物序列如SEQ ID NO:29所示；扩增U-fcoA2的R端引物序列如SEQID NO:30所示；扩增Cmg的F端引物序列如SEQ ID NO:31所示；扩增Cmg的R端引物序列如SEQID NO:32所示；扩增PxylA的F端引物序列如SEQ ID NO:33所示；扩增PxylA的R端引物序列如SEQ ID NO:34所示；扩增lacYg的F端引物序列如SEQ ID NO:35所示；扩增lacYg的R端引物序列如SEQ ID NO:36所示；扩增D-fcoA2的F端引物序列如SEQ ID NO:37所示；扩增D-fcoA2的R端引物序列如SEQ ID NO:38所示；所述5个DNA片段PCR扩增后进行融合，获得融合片段fcoA2-PxylA-lacY，然后转入重组枯草芽孢杆菌1643FL，筛选阳性转化子即得到重组枯草芽孢杆菌1643FL-fcoA2；

所述重组枯草芽孢杆菌1643FL-fcoA1通过如下方法构建：

制备线性DNA fcoA1-PxylA-lacY，它是由5个片段经过融合PCR获得，这5个片段分别是U-fcoA1、Cmy、PxylA、lacYy和D-fcoA1；其中，U-fcoA1和D-fcoA1以枯草芽孢杆菌ATCC6051a基因组为模板扩增；lacYy以大肠杆菌BL21（DE3）为模板；PxylA和Cmy以人工合成的DNA片断为模板；PCR扩增的引物序列如下：扩增U-fcoA1的F端引物序列如SEQ ID NO:39所示；扩增U-fcoA1的R端引物序列如SEQ ID NO:40所示；扩增Cmy的F端引物序列如SEQ IDNO:41所示；扩增Cmy的R端引物序列如SEQ ID NO:32所示；扩增PxylA的F端引物序列如SEQID NO:33所示；扩增PxylA的R端引物序列如SEQ ID NO:34所示；扩增lacYy的F端引物序列如SEQ ID NO:35所示；扩增lacYy的R端引物序列如SEQ ID NO:42所示；扩增D-fcoA1的F端引物序列如SEQ ID NO:43所示；扩增D-fcoA1的R端引物序列如SEQ ID NO:44所示；所述5个DNA片段PCR扩增后进行融合，获得融合片段fcoA1-PxylA-lacY，然后转入重组枯草芽孢杆菌1643FL，筛选阳性转化子即得到重组枯草芽孢杆菌1643FL-fcoA1。

2.如权利要求1所述的生产3-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌ATCC 6051a。

3.权利要求1-2任一项所述的重组枯草芽孢杆菌的应用，其特征在于：使用所述重组枯草芽孢杆菌1643FL、1643FL-fcoA2或者1643FL-fcoA1发酵生成3-岩藻糖基乳糖。