[发明专利]生产3-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种生产3‑岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用。所述重组枯草芽孢杆菌为重组枯草芽孢杆菌1643FL、1643FL‑fcoA2、1643FL‑fcoA1；所述重组枯草芽孢杆菌1643FL通过在枯草芽孢杆菌的manA位点整合编码甘露糖6‑磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖‑1‑磷酸鸟苷基转移酶的融合基因片段，以及在xylA‑xylB位点整合编码GDP‑甘露糖脱水酶、GDP‑L‑岩藻糖合成酶、α‑1,3岩藻糖基转移酶的融合基因片段获得；所述重组枯草芽孢杆菌1643FL‑fcoA2通过在重组枯草芽孢杆菌1643FL的fcoA2位点整合编码乳糖渗透酶的基因片段获得；所述重组枯草芽孢杆菌1643FL‑fcoA1通过在重组枯草芽孢杆菌1643FL的fcoA1位点整合编码乳糖渗透酶的基因片段获得。本发明的重组枯草芽孢杆菌能够利用比较廉价的碳源高产量生产3‑岩藻糖基乳糖。

技术领域

本发明属于枯草芽孢杆菌重组菌株构建技术领域，具体涉及一种生产3-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用。

背景技术

母乳寡糖(human milk oligosaccharides,HMOs)在母乳中含量高达15g/L，是母乳中乳糖和脂类之后第三丰富的组分。其中，包括2’-FL(2’-岩藻糖基乳糖)和3-FL(3-岩藻糖基乳糖)在内的岩藻糖基化寡糖是母乳所独有的。3-FL可以抑制病原菌在上皮细胞上的附着，从而有预防感染疾病的作用，同时，配方奶粉中添加3-FL可以减少婴儿腹泻症状。因此，3-FL兼具医学和营养学价值。

和2’-FL一样，3-FL可以通过在人乳中分离出来，也可以通过化学手段或酶催化法合成。近年来有文献报道可以通过代谢工程和发酵工程技术，利用微生物生产2’-FL，具有工业化的潜力。3-FL可以以GDP-L-岩藻糖和乳糖为底物，在α-1,3-岩藻糖基转移酶(α-1,3-fucosyltransferase)的催化下合成。所以，代谢工程的工作集中在构建或优化GDP-L-岩藻糖的合成途径，乳糖转运途径的优化及消耗途径的敲除，以及筛选表达特异高效的α-1,3-岩藻糖基转移酶基因。其中，在微生物体内GDP-L-岩藻糖的合成可以通过两种途径实现，一种是从头合成途径，主要包括果糖-6-磷酸经由5个酶促反应催化生成GDP-L-岩藻糖，这个途径在培养基中添加廉价的碳源，如甘油、葡萄糖等；一种是补救合成途径，可以由岩藻糖经2个酶促反应催化生成GDP-L-岩藻糖，这个途径需要往培养基中添加相对昂贵的岩藻糖作为底物。

作为GRAS(Generally Regarded As Safe)菌种，枯草芽孢杆菌不产致热源、内毒素，无毒副作用，可以减轻后续的分离纯化成本，天然适合用来表达生产人乳寡糖。目前还没有实现利用枯草芽孢杆菌进行3-FL合成的技术或报道。

发明内容

本发明的目的是，提供一种生产3-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用；提供一种利用枯草芽孢杆菌进行3-FL从头合成的技术方案。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

生产3-岩藻糖基乳糖的重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌为重组枯草芽孢杆菌1643FL、重组枯草芽孢杆菌1643FL-fcoA2、或者重组枯草芽孢杆菌1643FL-fcoA1；

所述重组枯草芽孢杆菌1643FL通过在枯草芽孢杆菌的manA位点整合编码甘露糖6-磷酸异构酶、磷酸甘露糖变位酶、甘露糖-1-磷酸鸟苷基转移酶的融合基因片段，以及在xylA-xylB位点整合编码GDP-甘露糖脱水酶、GDP-L-岩藻糖合成酶、α-1,3岩藻糖基转移酶的融合基因片段获得；

所述重组枯草芽孢杆菌1643FL-fcoA2通过在重组枯草芽孢杆菌1643FL的fcoA2位点整合编码乳糖渗透酶的基因片段获得；

所述重组枯草芽孢杆菌1643FL-fcoA1通过在重组枯草芽孢杆菌1643FL的fcoA1位点整合编码乳糖渗透酶的基因片段获得。