[发明专利]检测剑麻紫色卷叶病植原体的实时荧光定量LAMP引物组及其应用

说明书

本发明公开了检测剑麻紫色卷叶病植原体的实时荧光定量LAMP引物组及其应用。紫色卷叶病植原体的LAMP引物组，由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸以及序列表中序列4所示的核苷酸组成。本检测方法具有特异性强、灵敏度高、易于操作、结果可靠的LAMP分子检测方法。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种检测剑麻紫色卷叶病植原体实时荧光定量LAMP引物对、试剂盒及检测方法。

背景技术

剑麻紫色卷叶病是一种毁灭性的病害，该病害给剑麻产业可造成巨大的损失。该病于2001年11月在海南昌江青坎农场首先发现，不到半年时间便迅速蔓延全场及周边农场，2003年1～2月份在广东省东方剑麻集团公司属下东方红、金星农业公司和国有火炬、五一等农场及周边农村剑麻发生零星病株，此后该病逐步蔓延到整个广东省。据不完全统计，截至2018年，仅广东湛江地区剑麻紫色卷叶病发病田块达10万亩，因发病严重而淘汰的剑麻种植面积高达3万亩，整个湛江地区的发病率达到30％，给广东省的剑麻产业造成了巨大的损失。本研究室经过多年的研究，已成功从剑麻紫色卷叶病株中检测出植原体，并通过新菠萝灰粉蚧传毒，首次证明了植原体为剑麻紫色卷叶病病原，新菠萝灰粉蚧为其传播媒介。

植原体与世界上的许多植物病害有关，引起多种重要作物的病害。如我国发生的枣疯病、小麦蓝矮病、槟榔黄化病以及国外发生的葡萄黄化病、椰子致死黄化病等[徐启聪(2009)中国各地不同枣树品种上枣疯病植原体的PCR检测及分子变异分析.微生物学报,49(11):1510-1519；Laimer M(2009)Resistance to viruses,phytoplasmas and theirvectors in the grapevine in Europe.a review.J.Plant Pathol.,91(1):7-23；Wu YF(2010)Identification of the phytoplasma associated with wheat blue dwarfdisease in China.Plant Dis.,94(8):977-985；Yang Y(2016)Molecularidentification of a 16SrII-A group-related phytoplasma associated withcinnamon yellow leaf disease in China.J.Phytopathol.,164(1):52-55；Gurr GM(2016)Coconut lethal yellowing diseases：a phytoplasma threat to palms ofglobal economic and social significance.Front.Plant Sci.,7:21.]。虽然，近年的研究表明可对植原体进行体外培养，但其培养条件极其苛刻[Contaldo N(2012)Axenicculture of plant pathogenic phytoplasmas.Phytopathol.Mediterr.,51(3)：607–617；Contaldo N(2016)Development and evaluation of different complex media forphytoplasma isolation and growth.J.Microbiol.Meth.,127:105–110.]多数实验室很难获得植原体的纯培养。因此，不能像其他的原核或真核生物一样采用传统的分离培养法获得纯培养后，对植原体进行系统的鉴定和分类等研究。因此，建立一种行之有效的检测方法，对寄主植物/昆虫媒介中植原体进行鉴定与监测，这是开展植原体病害病理学、流行学及防治等研究工作必不可少的第一步[范国权(2015)植原体病害研究进展.黑龙江农业科学,(11):148-153；王洁(2017)柿树带化病相关植原体的形态及分子鉴定.植物生理学报,53(2)：219–226；Li S(2015)Occurrence and identification of a new vector of riceorange leaf phytoplasma in South China.Plant Dis.99:1483-1487；López-Romero JC(2018)Biological activities of Agave by-products and their possibleapplications in food and pharmaceuticals.J.Sci.Food Agric.,2018,98:2461–2474.]。