[发明专利]一种用于CRISPR-Cas9定点突变编辑DNMT1基因的试剂及其应用有效
申请号: | 202011226227.X | 申请日: | 2020-11-05 |
公开(公告)号: | CN112553195B | 公开(公告)日: | 2022-04-05 |
发明(设计)人: | 徐湘民;龚艺;张倩倩;叶宇华;邵聪文 | 申请(专利权)人: | 南方医科大学 |
主分类号: | C12N15/113 | 分类号: | C12N15/113;C12N9/22;C12N5/10 |
代理公司: | 广州粤高专利商标代理有限公司 44102 | 代理人: | 赵崇杨 |
地址: | 510515 广东省广州*** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 用于 crispr cas9 定点 突变 编辑 dnmt1 基因 试剂 及其 应用 | ||
1.一种用于CRISPR-Cas9定点突变编辑
所述单链引导RNA序列为:
mU*mg*mU*UggcUgggUUUUUggagGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU;
所述寡聚脱氧核苷酸模板序列为:
C*G*ACGGGAAGACCTACTTCTACCAGCTGTGGTATGATCAAGACTACGCGAGATTCGAGTTCCCTCCAAAAACCCAGCCAACAGAGGACAACAAGTTCAAGTGAGCACTGGGGCTGGAC*T*C;
所述定点突变为c.2633GA;
上述序列中,m:核苷酸糖/脱氧核苷酸中核糖/脱氧核糖的2’-O-甲基修饰;*:核苷酸/脱氧核苷酸间的硫代磷酸酯连接修饰。
2.根据权利要求1所述试剂,其特征在于,还包含重组Cas9蛋白。
3.权利要求1或2所述试剂在制备
4.一种定点突变编辑
5.根据权利要求4所述制备方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
S1.对细胞进行培养和增殖、传代培养;
S2.对培养中的细胞进行换液,换液后取5~6×105个细胞离心弃上清,清洗,再离心弃上清;
S3.向细胞沉淀中加入电转液将细胞吹匀打散,随后向细胞悬液中加2~4%甘油、重组Cas9蛋白、单链引导RNA、单链寡核苷酸序列,进行电转;
S4.电转后的细胞放入细胞孵箱进行培养,再进行低速离心,随后将细胞重悬,进行单克隆分选,分选的单克隆细胞分别培养,挑选长起来的单克隆细胞继续生长培养,再验证细胞目的位点突变编辑情况,选取纯合突变的单克隆细胞株。
6.根据权利要求5所述制备方法,其特征在于,步骤S3所述重组Cas9蛋白添加量为15~17μg。
7.根据权利要求5所述制备方法,其特征在于,步骤S3所述单链引导RNA添加量为200~300pM。
8.根据权利要求5所述制备方法,其特征在于,步骤S3所述单链寡核苷酸序列添加量为20~30pM。
9.根据权利要求5所述制备方法,其特征在于,所述细胞为永生化红系祖细胞。
10.权利要求4~9任一所述方法制备得到的
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