[发明专利]一种用于CRISPR-Cas9定点突变编辑DNMT1基因的试剂及其应用有效

专利信息
申请号: 202011226227.X 申请日: 2020-11-05
公开(公告)号: CN112553195B 公开(公告)日: 2022-04-05
发明(设计)人: 徐湘民;龚艺;张倩倩;叶宇华;邵聪文 申请(专利权)人: 南方医科大学
主分类号: C12N15/113 分类号: C12N15/113;C12N9/22;C12N5/10
代理公司: 广州粤高专利商标代理有限公司 44102 代理人: 赵崇杨
地址: 510515 广东省广州*** 国省代码: 广东;44
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摘要:
搜索关键词: 一种 用于 crispr cas9 定点 突变 编辑 dnmt1 基因 试剂 及其 应用
【权利要求书】:

1.一种用于CRISPR-Cas9定点突变编辑DNMT1基因的试剂,其特征在于,包含单链引导RNA和寡聚脱氧核苷酸模板;

所述单链引导RNA序列为:

mU*mg*mU*UggcUgggUUUUUggagGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU;

所述寡聚脱氧核苷酸模板序列为:

C*G*ACGGGAAGACCTACTTCTACCAGCTGTGGTATGATCAAGACTACGCGAGATTCGAGTTCCCTCCAAAAACCCAGCCAACAGAGGACAACAAGTTCAAGTGAGCACTGGGGCTGGAC*T*C;

所述定点突变为c.2633GA;

上述序列中,m:核苷酸糖/脱氧核苷酸中核糖/脱氧核糖的2’-O-甲基修饰;*:核苷酸/脱氧核苷酸间的硫代磷酸酯连接修饰。

2.根据权利要求1所述试剂,其特征在于,还包含重组Cas9蛋白。

3.权利要求1或2所述试剂在制备DNMT1基因定点突变细胞模型中的应用。

4.一种定点突变编辑DNMT1基因的细胞模型的制备方法,其特征在于,利用CRISPR/Cas9技术和权利要求1或2所述试剂对细胞进行定点单碱基编辑;所述定点突变为c.2633GA。

5.根据权利要求4所述制备方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:

S1.对细胞进行培养和增殖、传代培养;

S2.对培养中的细胞进行换液,换液后取5~6×105个细胞离心弃上清,清洗,再离心弃上清;

S3.向细胞沉淀中加入电转液将细胞吹匀打散,随后向细胞悬液中加2~4%甘油、重组Cas9蛋白、单链引导RNA、单链寡核苷酸序列,进行电转;

S4.电转后的细胞放入细胞孵箱进行培养,再进行低速离心,随后将细胞重悬,进行单克隆分选,分选的单克隆细胞分别培养,挑选长起来的单克隆细胞继续生长培养,再验证细胞目的位点突变编辑情况,选取纯合突变的单克隆细胞株。

6.根据权利要求5所述制备方法,其特征在于,步骤S3所述重组Cas9蛋白添加量为15~17μg。

7.根据权利要求5所述制备方法,其特征在于,步骤S3所述单链引导RNA添加量为200~300pM。

8.根据权利要求5所述制备方法,其特征在于,步骤S3所述单链寡核苷酸序列添加量为20~30pM。

9.根据权利要求5所述制备方法,其特征在于,所述细胞为永生化红系祖细胞。

10.权利要求4~9任一所述方法制备得到的DNMT1定点突变细胞模型。

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