[发明专利]一种用于CRISPR-Cas9定点突变编辑DNMT1基因的试剂及其应用

权利要求书

1.一种用于CRISPR-Cas9定点突变编辑DNMT1基因的试剂，其特征在于，包含单链引导RNA和寡聚脱氧核苷酸模板；

所述单链引导RNA序列为：

mU*mg*mU*UggcUgggUUUUUggagGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU；

所述寡聚脱氧核苷酸模板序列为：

C*G*ACGGGAAGACCTACTTCTACCAGCTGTGGTATGATCAAGACTACGCGAGATTCGAGTTCCCTCCAAAAACCCAGCCAACAGAGGACAACAAGTTCAAGTGAGCACTGGGGCTGGAC*T*C；

所述定点突变为c.2633GA；

上述序列中，m：核苷酸糖/脱氧核苷酸中核糖/脱氧核糖的2’-O-甲基修饰；*：核苷酸/脱氧核苷酸间的硫代磷酸酯连接修饰。

2.根据权利要求1所述试剂，其特征在于，还包含重组Cas9蛋白。

3.权利要求1或2所述试剂在制备DNMT1基因定点突变细胞模型中的应用。

4.一种定点突变编辑DNMT1基因的细胞模型的制备方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9技术和权利要求1或2所述试剂对细胞进行定点单碱基编辑；所述定点突变为c.2633GA。

5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

S1.对细胞进行培养和增殖、传代培养；

S2.对培养中的细胞进行换液，换液后取5～6×10⁵个细胞离心弃上清，清洗，再离心弃上清；

S3.向细胞沉淀中加入电转液将细胞吹匀打散，随后向细胞悬液中加2～4%甘油、重组Cas9蛋白、单链引导RNA、单链寡核苷酸序列，进行电转；

S4.电转后的细胞放入细胞孵箱进行培养，再进行低速离心，随后将细胞重悬，进行单克隆分选，分选的单克隆细胞分别培养，挑选长起来的单克隆细胞继续生长培养，再验证细胞目的位点突变编辑情况，选取纯合突变的单克隆细胞株。

6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，步骤S3所述重组Cas9蛋白添加量为15～17μg。

7.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，步骤S3所述单链引导RNA添加量为200～300pM。

8.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，步骤S3所述单链寡核苷酸序列添加量为20～30pM。

9.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，所述细胞为永生化红系祖细胞。

10.权利要求4～9任一所述方法制备得到的DNMT1定点突变细胞模型。