[发明专利]一种用于CRISPR-Cas9定点突变编辑DNMT1基因的试剂及其应用

说明书

本发明公开了一种用于CRISPR‑Cas9定点突变编辑DNMT1基因的试剂及其应用。所述试剂包含特定的单链引导RNA和寡聚脱氧核苷酸模板，通过特定的单链引导RNA序列靶向目标序列，以寡聚脱氧核苷酸模板作为基因修复模板，从而引入单个位点的突变，对DNMT1基因进行单碱基编辑，以制备生成携带该DNMT1定点突变的细胞株；可进一步利用该突变的细胞株来研究该DNMT1突变对γ‑珠蛋白基因(HBG)表达水平的影响极其作用机制，具有较大的应用前景。

技术领域

本发明涉及细胞模型及基因编辑技术领域，更具体地，涉及一种用于CRISPR-Cas9定点突变编辑DNMT1基因的试剂及其应用。

背景技术

DNA甲基转移酶1(DNMT1)在人体许多组织结构中广泛且高表达，正常生理状态下用于维持特定DNA位点的甲基化水平，介导下游基因的表达沉默。DNMT1蛋白包括位于氮端的调控区域(N-terminal regμLatory domain)和位于碳端的催化区域(C-terminalcatalytic domain)，这两个区域之间形成一定的空间结构，相互作用，协同完成DNMT1的催化功能。氮端调控区域由多个不同的结构域组成，包括：PCNA结合结构域(proliferatingcell nuclear antigen(PCNA)binding domain，PBD)、TS结构域(targeting sequencedomain，TS)、锌指蛋白结构域(zinc finger domain，CXXC)、两个BAH结构域(bromo-adjacent homology domains，BAH1/2)，每种结构域在DNMT1的功能调节中都发挥着不同的作用。针对49个已报道的与珠蛋白基因表达相关的表观调控因子，对中国南方地贫高发地区的1142例β地贫患者进行目标区域捕获测序，发现了位于DNMT1蛋白BAH1结构域的错义突变(NM_001317830.1:c.2633C＞T,p.Ser878Phe)能显著升高胎儿血红蛋(Hb F)水平，减轻β地贫表型。然而，DNMT1蛋白BAH1结构域的错义突变通过何种机制影响病人的表型并不清楚。因此，通过在HUDEP-2细胞株中构建DNMT1(c.2633GA,p.Ser878Phe)突变模型对于探讨其对β-地中海贫血患者的γ-珠蛋白基因重新激活表达的分子机制至关重要。CRISPR/Cas9技术是近几年兴起的基因编辑技术，通过设计合适的sgRNA，可对目标序列进行定点编辑，具有快速、高效的特点。中国专利CN109971755A公开了一种CRISPR/Cas9系统的特异性靶向人DNMT1基因的sgRNA，及其CRISPR/Cas9载体，可快速高效、特异性敲除人DNMT1基因，促使肿瘤细胞中DNMT1基因失活，抑制DNMT1的表达及其对DNA的甲基化作用，从而抑制肿瘤细胞生长，然而其并不能实现DNMT1的定点突变，因此无法适用于构建DNMT1(c.2633GA,p.Ser878Phe)突变模型。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种用于CRISPR-Cas9定点突变编辑DNMT1基因(c.2633GA)的试剂。

本发明的第二个目的在于提供所述试剂在制备DNMT1基因定点突变细胞模型中的应用。

本发明的第三个目的在于提供一种定点突变编辑DNMT1基因(c.2633GA)的细胞模型的制备方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种用于CRISPR-Cas9定点突变编辑DNMT1基因(c.2633GA)的试剂，包含单链引导RNA和寡聚脱氧核苷酸模板；

所述单链引导RNA序列为：

mU*mg*mU*UggcUgggUUUUUggagGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU；

所述寡聚脱氧核苷酸模板序列为：