[发明专利]一种高通量靶向建库的方法和应用

权利要求书

1.一种高通量靶向建库的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)基于检测的基因设计并合成靶向捕获探针；

(2)将样本基因组DNA和步骤(1)所述的靶向捕获探针杂交过夜，得到捕获的目的片段，环化，酶切，纯化，PCR扩增，得到构建的靶向测序文库；

(3)将步骤(2)所述的靶向测序文库纯化，检测文库DNA片段浓度和大小，进行二代测序，根据测序结果分析判断靶向测序文库的质量和测序信息。

2.根据权利要求1所述的高通量靶向建库的方法，其特征在于，

步骤(1)所述的靶向捕获探针的骨架为5'端测序引物ATCCGACGGTAGTGT和3'端测序引物CTTCAGCTTCCCGAT，靶向捕获探针的骨架两端分别为靶向目的基因位点两端的靶向片段，左右各15-30nt，目的基因片段长度为100-200nt；

步骤(1)所述的靶向捕获探针序列为：5'-NNNNNCTTCAGCTTCCCGATATCCGACGGTAGTGTNNNNN-3'；其中，NNNNN分别为靶向目的基因位点两端的靶向片段；

步骤(2)所述的PCR扩增的引物中，上游引物为：adaptor序列-barcode序列-间隔序列-连接序列-靶向捕获探针骨架5'测序引物的相同序列；

步骤(2)所述的PCR扩增的引物中，下游引物为：测序平台的另一个adaptor序列和连接序列-靶向捕获探针骨架3’测序引物的反向互补序列；

步骤(2)所述的PCR扩增得到的序列为：上游引物–NNNNN–捕获的目的基因序列–NNNNN–3'端测序引物；其中，捕获的目的基因序列为SNP位点，为100-200nt；NNNNN分别为靶向目的基因位点两端的靶向片段。

3.根据权利要求2所述的高通量靶向建库的方法，其特征在于，

所述的上游引物为：5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG-NNNNN-GAT-ACACGCACG-ATCCGACGGTAGTGT-3'；所述NNNNN为barcode序列；

所述的下游引物为：5'-TCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGATCATACGAGATCCGTA-ATCGGGAAGCTGAAG-3'。

4.根据权利要求1所述的高通量靶向建库的方法，其特征在于，

步骤(1)所述的靶向捕获探针是用TE buffer(PH 8.0)溶解，将溶解后的探针混合，配置成探针混合液，再将探针混合液中的探针5'端加磷酸基团得到的靶向捕获探针；

所述的探针混合液的总浓度为100uM，每个探针的浓度为总浓度除以探针数，探针混合液中每一种探针加入量为1uL。

5.根据权利要求1-3任一项所述的高通量靶向建库的方法，其特征在于，

步骤(1)所述的基因包括肿瘤治疗药物相关基因和药物代谢相关基因；

步骤(1)所述的靶向捕获探针的骨架匹配Illumina测序平台；

所述的adaptor序列匹配测序平台PGM；

所述的测序平台的另一个adaptor序列配测序平台PGM。

6.根据权利要求5所述的高通量靶向建库的方法，其特征在于，

步骤(2)所述的基因组DNA提取的样本为石蜡标本和外周血白细胞；

步骤(2)所述的基因组DNA与靶向捕获探针按500ng：1～100pmol的比例混合；

步骤(2)中所述的PCR扩增的反应体系：0.5uL Phusion酶、10uL 5×buffer、0.5uL10nM的dNTP、5uL模板、2.5nM的上下游引物各2uL，ddH₂O补充至50uL；

步骤(2)中所述的PCR扩增的反应条件：98℃、3min；98℃、20s，60℃、30s，72℃、30s，一共35个循环；72℃、5min。