[发明专利]一种高通量靶向建库的方法和应用

说明书

本发明公开一种高通量靶向建库的方法和应用。本发明的方法包括如下步骤：基于检测的基因设计并合成靶向捕获探针和PCR扩增引物；将样本基因组DNA和靶向捕获探针杂交过夜，得到捕获的目的片段，环化，酶切，纯化，PCR扩增，得到构建的靶向测序文库；靶向测序文库纯化，检测文库DNA片段浓度和大小，二代测序，根据测序结果分析靶向测序文库的质量和测序信息。本发明能够在一轮PCR反应中扩增上百个检测基因，解决了多重PCR建库只能检测少量基因位点、实验条件难优化的不足；只有一轮PCR，且探针骨架上有随机barcode，减少PCR偏倚，能够区别PCR和测序引入的碱基错误；简化了建库步骤，减少了试剂和时间成本。

技术领域

本发明涉及测序检测技术领域，特别涉及一种高通量靶向建库的方法和应用。

背景技术

新一代测序在分子检测中得到越来越多的认同和应用；可以分为靶向测序，全转录组测序和全基因组测序。靶向测序是获取疾病相关基因信息高效可行的方法，但由于关键环节受限于现有的方法，费用仍然较为昂贵，且存在操作繁琐和灵敏度不高等不足。靶向建库是基因靶向测序的关键环节，目前国内外测序靶向建库方法主要采用多重PCR或探针捕获的方法。多重PCR建库实验条件摸索难度较大，且存在检测基因数目较少，无法去除PCR偏倚，检测方法灵敏度不高等缺点。探针捕获建库的方法需要合成特制的探针，成本高昂。这两种技术价格昂贵，也无法根据实际需求而快速灵活地应用。发明人整合上述两种方法，并对诸多技术点进行改进，提出一种反转探针捕获PCR的建库方法。反转探针捕获PCR建库方法利用常规分子试剂即可完成建库，大大降低实验条件摸索的难度，降低成本，提高灵敏度。该方法有望应用于药物代谢基因、疾病相关基因和肿瘤突变基因检测等，具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种高通量靶向建库的方法。

本发明的另一目的在于提供上述高通量靶向建库的方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种高通量靶向建库的方法，包括如下步骤：

(1)基于检测的基因设计并合成靶向捕获探针；

步骤(1)所述的靶向捕获探针(MIP)的骨架为5'端测序引物ATCCGACGGTAGTGT和3'端测序引物CTTCAGCTTCCCGAT，靶向捕获探针的骨架两端分别为靶向目的基因位点两端的靶向片段，左右各15-30nt，目的基因片段长度为100-200nt。

步骤(1)所述的靶向捕获探针序列为：NNNNNCTTCAGCTTCCCGATATCCGACGGTAGTGTNNNNN；其中NNNNN分别为靶向目的基因位点两端的靶向片段。

步骤(1)所述的靶向捕获探针是用TE buffer(PH 8.0)溶解，将溶解后的探针混合，配置成探针混合液(probe mix)，再将探针混合液中的探针5'端加磷酸基团得到的靶向捕获探针。

所述的探针混合液的总浓度为100uM，每个探针的浓度为总浓度除以探针数，探针混合液中每一种探针加入量为1uL。

步骤(1)所述的基因包括肿瘤治疗药物相关基因和药物代谢相关基因。

步骤(1)所述的靶向捕获探针的骨架匹配Illumina测序平台。

(2)将样本基因组DNA和步骤(1)所述的靶向捕获探针杂交过夜，得到捕获的目的片段，环化，酶切，纯化，PCR扩增，得到构建的靶向测序文库；

步骤(2)所述的基因组DNA提取的样本优选为石蜡标本和外周血白细胞。

步骤(2)所述的基因组DNA与靶向捕获探针按500ng：1～100pmol的比例混合；优选为按500ng：3pmol的比例混合。