[发明专利]pC1300-MAS-Cas9基因编辑系统在84K杨树基因编辑中的应用

权利要求书

1.pC1300-MAS-Cas9基因编辑系统在84K杨树基因编辑中的应用，其步骤如下：

步骤（1）：PagPDS基因靶位点的选择

根据84K杨基因序列，找到PagPDS基因的CDS区并分析结构，查找潜在的Cas9靶位点，并根据所需靶位点的位置和GC含量设计gRNA；

步骤（1）中，PagPDS基因，PagPDS form P. glandulosa序列见序列表中序列1，PagPDSform P. alba序列见序列表中序列2；

步骤（2）：gRNA的设计

根据PAM序列的设计原则，在不含SNP位点的序列中设计3个gRNA，分别是gRNA1、gRNA2、gRNA3，分别见序列表中序列9-11；

步骤（3）：CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建

1）寡核苷酸退火聚合

根据后续连接的载体接头序列，设计带特定接头的脱盐寡核苷酸链，已合成的寡核苷酸引物，用ddH₂0水稀释；退火反应体系：1μL正义寡核苷酸，1μL反义寡核苷酸，加ddH₂0补足到50μL，将配制好的退火反应缓冲液混合均匀，短暂离心，然后使用PCR仪，95℃，5min，室温放置20min，引物混合后变形退火，形成带有粘性末端的寡核苷酸片段，室温放置完毕后，寡核苷酸片段立刻使用或放置在‐20℃长期保存；

2）单个中间载体的构建

将gRNA序列插入含有SK-gRNA的载体中，SK-gRNA的序列如序列表中序列12所示；将gRNA1、gRNA2、gRNA3通过AarI酶连接到SK-gRNA中；

3）多个中间载体聚合

利用BamHI 和BglII 是同尾酶的属性，进行3个 SK-gRNA 中间载体的聚合，作为载体的用KpnI 和BamHI 进行酶切，提供片段的SK-gRNA1，使用KpnI+ Sal I进行酶切；SK-gRNA2使用XhoI +XbaI进行酶切；SK-gRNA3使用Spel+BgI II进行酶切；

4）构建至最终载体

pC1300-Cas9 载体用KpnI和BamHI进行酶切，SK-gRNA用KpnI和BglII进行酶切并回收片段，并用终载连接体系将片段连接到 pC1300-Cas9 载体上；

终载体pC1300-Cas9用KpnI 和BamH I酶切、回收；将三个中间载体同时连接到带有KpnI 和BamH I酶切位点的终载体pC1300-Cas9，分别由2x35S和MAS启动子启动；

5）转化感受态

转化后，取100µl涂板，次日，在LB+Kan板上挑取单克隆10个，用1.5mL的离心管加LB+Kan，在37℃，250rmp的摇床中进行摇菌，菌摇好后，进行PCR检测并测序；

步骤（4）：杨树的遗传转化

步骤（5）：转基因植株的获得与统计

通过农杆菌转化叶盘法分别获得PagPDS-2x35S-Cas9和PagPDS-MAS-Cas9转基因植株40棵，两个载体的转基因植株中均有白化表型；其中，PagPDS-2x35S-Cas9中，40棵转基因植株中，白化苗27棵，突变率为67.5%，其中，21棵为纯白化表型，6棵为黄绿色表型；PagPDS-MAS-Cas9中，40棵转基因植株中，白化苗30棵，其中，23棵为纯白标型，7棵为黄绿色表型；

步骤（6）：CRISPR系统对杨树基因的定向编辑

1）转基因植株DNA水平鉴定

叶片经过农杆菌浸染之后，在含有Hyg的筛选培养基中筛选生长，材料经过分化—伸长—生根过程之后，对生根的抗性苗进行鉴定；

2）转基因植株的突变鉴定

在获得阳性的转基因植株后，利用gRNA靶位点检测的特异性引物，PCR扩增，获得带有潜在靶位点修饰的DNA序列片段，然后，将片段电泳分离后，连接到T载体上，转化大肠杆菌，获得单菌落，然后提取质粒，用于靶位点的测序，将测序结果与对照序列比较，分析突变事件。

2.根据权利要求1所述的pC1300-MAS-Cas9基因编辑系统在84K杨树基因编辑中的应用，其特征在于：

步骤（3）的2）中，具体如下：首先将SK-gRNA进行Aar I 酶切，形成带有粘性末端的载体，gRNA混合后变性退火，形成带有粘性末端的片段，将载体和片段进行连接，转化DH5得到连接质粒，并测序。