[发明专利]pC1300-MAS-Cas9基因编辑系统在84K杨树基因编辑中的应用

说明书

本发明涉及一种pC1300‑MAS‑Cas9基因编辑系统在84K杨树基因编辑中的应用，属于植物基因工程技术领域。包括PagPDS基因靶位点的选择；gRNA的设计；CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建；杨树的遗传转化；转基因植株的获得与统计；CRISPR系统对杨树基因的定向编辑。本发明的pC1300‑MAS‑Cas9基因编辑系统在84K杨树基因编辑中的应用简单、快速、高效，运用同尾酶原理构建了多基因编辑的系统，该系统以pC1300‑Cas9和SK‑gRNA为骨架载，理论上，该系统可用于同时编辑无限数量的靶基因。本发明还优化了启动子，用MAS启动子驱动Cas9，并在84K杨中研究其编辑效率。

技术领域

本发明涉及CRISPR/Cas9基因编辑系统在木本植物基因编辑中的应用，特别涉及pC1300-MAS-Cas9基因编辑系统在84K杨树基因编辑中的应用，即MAS启动子驱动的Cas9基因编辑系统在84K杨树基因编辑中的应用，属于生物基因工程技术领域。

背景技术

II型CRISPR/Cas9系统是来自链球菌属的一种获得性免疫系统，能够抵御外源基因的入侵。经过人工修饰，这种系统在动植物中得到了广泛应用。它主要由CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)和特异的Cas9蛋白组成。CRISPR是一成簇的规律间隔的短回文DNA重复序列，它由一系列短的高度保守的正向重复序列和长度相似的序列间隔排列组成。Cas9蛋白是一种由1409个氨基酸组成的多结构域蛋白，含有两个核酸酶结构域RuvC-like和HNH。CRISPR/Cas9系统于2013年被Seung等人(Seung Woo Cho et al.,2013)首次成功运用于真核细胞的基因编辑。基于CRISPR/Cas9的基因编辑体系包括两部分：sgRNA及酶Cas9。这种系统能够特异的识别毗邻PAM(NGG)基序的靶序列，并在其上游3nt处进行切割，同时，RuvC-like结构域，在PAM区上游3～8nt处进行切割，形成DSB(double strains break双链断裂)，随后，机体通过自身的修复机制如同源重组、非同源重组来修复损伤的DNA，进而产生Indel(包括缺失和插入)的现象。应用于植物上的CRISPR/Cas9载体构建体系包括基于基因枪转化的载体构建体系和基于农杆菌转化的载体构建体系。在目前普遍使用的植物农杆菌转化方面，基于CRISPR/Cas9技术的植物基因敲除载体体系构建过程比较繁琐，需要多步才能将各个部分整合到双元载体上。

杨树是木本植物研究的模式植物，也是纸张、木材、建筑材料以及生物燃料的重要来源，具有很高的经济和生态价值(Jansson and Douglas，2007)。‘84K’杂交杨(Populusalba x P.glandulosa)，在中国北方广泛种植，同时也是多家研究机构用于维管形成层活性、木材形成的理想研究材料。‘84K’杂交杨基因组序列已发表(Huanget al.,2019)，遗传背景较为清晰，遗传转化率高(Liet al.,2017)。因此我们选择‘84K’杂交杨进行基因编辑载体的构建以及编辑效率的优化的技术研究。

基于CRISPR/CAS9的基因编辑技术已经应用于木本植物的基因编辑。美国乔治亚大学(UGA)的研究人员首次利用CRISPR/Cas9基因编辑工具，通过基因编辑敲除4CL基因等木质素合成的关键酶基因，可以有效降低木材中的木质素含量(Zhou,Jacobs etal.2015)。西南大学罗克明利用CRISPR/Cas9系统，设计了四个引导RNA(gRNA)，靶定毛白杨八氢番茄红素脱氢酶基因8(PtoPDS)的不同基因组位点，有效编辑了木本植物中基因组序列(Fan,Liu et al.2015)。由于杨树的基因组的复杂程度高，目前CRISPR/CAS9载体的在杨树不同地方品种中的基因组编辑效率普遍较低。亟需改造骨架载体，优化基因编辑效率来提高Cas9在杨树基因组中的基因编辑效率。