[发明专利]一种同时检测灵芝菌丝体中八种灵芝酸的方法有效

专利信息
申请号: 202011236822.1 申请日: 2020-11-06
公开(公告)号: CN112345681B 公开(公告)日: 2023-02-03
发明(设计)人: 冯娜;周帅;张劲松;岳亚文;唐庆九;冯杰;王金艳 申请(专利权)人: 上海市农业科学院
主分类号: G01N30/88 分类号: G01N30/88;G01N30/86
代理公司: 上海容慧专利代理事务所(普通合伙) 31287 代理人: 张竹梅
地址: 201106 *** 国省代码: 上海;31
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摘要:
搜索关键词: 一种 同时 检测 灵芝 菌丝体 中八种 方法
【权利要求书】:

1.一种同时检测灵芝菌丝体中八种灵芝酸的方法,其特征在于该方法包括如下步骤:

(1)灵芝菌丝体的预处理步骤:将灵芝菌丝体加入甲醇进行超声提取,按料液比1:20-40,重量g:体积ml,取上清液,用0.20μm孔径的有机相微孔滤膜过滤,得到的滤液稀释后即为待测样品溶液;配制八个灵芝酸的混合标准品溶液;

(2)超高效液相色谱检测步骤:对待测样品溶液和八个灵芝酸混合标准品溶液进行超高效液相色谱分离;选用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱,1.8μm,2.1×150mm,检测波长:230nm;柱温:35℃;室温:20℃;上样量为4uL;流速:0.4mL/min;压力:800bar;流动相A:0.01%冰醋酸;流动相B:乙腈;洗脱程序:0min,45%A,55%B;5min,45%A,55%B;25min,25%A,75%B;30min,15%A,85%B;32min,0%A,100%B;35min,0%A,100%B;

(3)化合物质谱信息获得步骤:利用质谱优化软件Agilent Optimizer,对八个灵芝酸化合物进行母离子扫描、子离子对的检出以及最佳碰撞能的寻找;

(4)超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用分析方法建立步骤:在数据采集软件Agilent MassHunter Data Acquisition中,在超高效液相色谱分析条件和三重四级杆质谱检测条件下,导入保留时间,母离子、子离子对以及碰撞能数据,建立八个灵芝酸化合物的动态多反应监测分析测定方法;同时,对八个灵芝酸的混合标准品溶液和样品溶液进行上样测定;

(5)数据分析步骤,运用定量分析软件Agilent MassHunter Quantitative Analysis,创建八个灵芝酸化合物的标准曲线,对所建方法进行方法学验证,并对灵芝菌丝体样品溶液进行定量分析;

其中步骤(4)中,以超高效液相色谱—三重四级杆质谱联用为分析检测仪器,其中超高效液相色谱分离的色谱条件为:选用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱,1.8μm,2.1×150mm,检测波长:230nm;柱温:35℃;室温:20℃;上样量为4uL;流速:0.4mL/min;压力:800bar;流动相A:0.01%冰醋酸;流动相B:乙腈;洗脱程序:0min,45%A,55%B;5min,45%A,55%B;25min,25%A,75%B;30min,15%A,85%B;32min,0%A,100%B;35min,0%A,100%B;质谱条件为:电喷雾电离源AJS ESI作为离子源,检测在负离子模式下进行,选用动态多反应监测DMRM,毛细管电压:3500V,毛细管出口电压:380V;干燥气流速:16L/min,干燥气温度:200℃,鞘气温度:320℃,鞘气流速:12L/min,喷嘴电压:2000V;

其中所述的八种灵芝酸为:

Ganoderic acid P;

Ganoderic acid T1;

Ganoderic acid Mk ;

Ganoderic acid S;

Ganoderic acid T;

Ganoderic acid Me;

Ganoderic acid R;

Lanosta-7, 9(11), 24-trien-3α-hydroxy-26-oic acid 。

2.根据权利要求1所述的同时检测灵芝菌丝体八种灵芝酸的方法,其中步骤(1)中八个灵芝酸的混合标准品溶液的配制方法为:取八种灵芝酸标准品,用质谱级甲醇配制为浓度为100μg/mL的混合标准溶液,再逐级稀释得到5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、500ng/mL、200 ng/mL、100 ng/mL、50 ng/mL、20 ng/mL的混合标准工作溶液。

3.根据权利要求1所述的同时检测灵芝菌丝体八种灵芝酸的方法,其中通过质谱优化软件Agilent Optimizer,获得步骤(3)中分析所需的各化合物的保留时间、母离子、子离子对及碰撞能信息如下:

Ganoderic acid P:保留时间:13.55min;母离子:569;定量离子:509.4,碰撞能:33;定性离子:59.1,碰撞能37;

Ganoderic acid T1:保留时间:13.92min;母离子:569;定量离子:98.8,碰撞能:21;定性离子:55.2,碰撞能41;

Ganoderic acid Mk :保留时间:15.50min;母离子:569;定量离子:509.3,碰撞能:33;定性离子:99.1,碰撞能37;

Ganoderic acid S:保留时间:19.50min;母离子:511;定量离子:451.4,碰撞能:25;定性离子:98.9,碰撞能37;

Ganoderic acid T :保留时间:20.90min;母离子:611;定量离子:551.3,碰撞能:29;定性离子:59.2,碰撞能45;

Ganoderic acid Me:保留时间:26.28min;母离子:553;定量离子:511.4,碰撞能:37;定性离子:59.2,碰撞能57;

Ganoderic acid R :保留时间:26.76min;母离子:553;定量离子:493.4,碰撞能:29;定性离子:59.1,碰撞能45;

Lanosta-7, 9(11), 24-trien-3α-hydroxy-26-oic acid :保留时间:27.60min;母离子:453;定量离子:393.3,碰撞能:37;定性离子:361.2,碰撞能45。

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