[发明专利]一种同时检测灵芝菌丝体中八种灵芝酸的方法

说明书

本发明提供了一种同时检测灵芝菌丝体中八种灵芝酸的方法，该方法包括如下步骤：(1)灵芝菌丝体的预处理步骤；(2)超高效液相色谱检测步骤；(3)化合物质谱信息获得步骤；(4)超高效液相色谱‑三重四级杆质谱联用分析方法建立步骤；(5)数据分析步骤。本发明的同时检测灵芝菌丝体中八种灵芝酸的方法，可以对灵芝发酵菌丝体中特定的八个灵芝酸化合物同时进行准确的定性定量分析，准确性高，灵敏度高，且专属性强，适用于灵芝菌丝体中灵芝酸类化合物的检测分析，从而为灵芝菌丝体的相关研究和产品提供精确可靠的检测分析方法。

技术领域

本发明涉及药用菌有效成分检测分析领域，具体的说涉及一种同时检测灵芝菌丝体中八种灵芝酸的方法。

背景技术

灵芝(Ganoderma sp.)是我国一种传统的药用真菌，根据现代药理研究，灵芝被认为具有抗肿瘤、抗病毒、防治心血管疾病、保护肝脏、抗氧化、免疫调节等诸多生物活性。目前，对灵芝的研究不仅集中在其子实体上，关于灵芝菌丝体的研究也有多项报道。学者已经从灵芝的发酵菌丝体中分离出来六十多种化合物，主要是灵芝酸、灵芝醇、甾醇等类型。由于处于生长发育的不同阶段，菌丝体中的这些化合物与子实体中相比，不仅化学结构不同，其生物活性也有一定差异。

目前，对灵芝菌丝体生物活性的研究多集中在其灵芝酸类化合物上。研究发现，菌丝体中的灵芝酸T(Ganoderic acid T)具有较强的体外抑制多种肿瘤细胞增殖的能力，进一步研究证实，灵芝酸T可以诱导肿瘤细胞发生晚期凋亡和坏死，通过防止细胞-细胞外基质相互作用和增强细胞-细胞聚集来抑制HCT-116肿瘤细胞的转移，此外，灵芝酸T还可以通过改变线粒体膜电位使得致凋亡活性物质如细胞色素C等的释放，或者诱导HeLa肿瘤细胞内的活性氧水平升高，从而达到抑制肿瘤细胞的目的。灵芝酸MK(Ganoderic acid Mk)和灵芝酸S(Ganoderic acid S)均能通过线粒体介导的途径诱导人HeLa细胞凋亡，但具有不同的细胞周期阻滞特异性。灵芝酸Me(Ganoderic acid Me)可通过抑制MDR1、MRPs的表达水平和调节凋亡相关通路，有效逆转MDR结肠癌细胞的多药耐药。另一项研究表明，灵芝酸Me还能增强小鼠lewis肺癌细胞中吲哚胺2，3-双加氧酶的表达和激活，导致T细胞凋亡和Treg细胞比例增加。

灵芝菌丝体中灵芝酸化合物不同于子实体中化合物，若要得到菌丝体灵芝酸化合物，首先需要发酵设备和相关技术，获得一定生物量的菌丝体，然后才能从中分离得到灵芝酸化合物，因此存在一定的难度。灵芝酸是灵芝菌丝体中主要的活性物质，因此，学者们多以灵芝酸为考察对象，用分光光度法或高效液相-紫外检测法对其进行定量。而市场上关于灵芝菌丝体为原料来源的保健品和药品，也大多以分光光度法检测三萜含量作为产品指标。事实上，无论是分光光度法，还是高效液相-紫外检测法，都存在缺陷。这是因为，灵芝菌丝体中不只有灵芝酸这类三萜化合物，还有麦角甾醇、啤酒甾醇等多种甾醇，和亚油酸、棕榈酸等不饱和脂肪酸，采用分光光度法分析时，这些物质均能和香草醛-冰醋酸和高氯酸等显色剂发生反应，影响测定的结果。而高效液相-紫外检测法也存在一定缺陷，因为该方法只能通过保留时间对灵芝酸化合物进行定性，由于菌丝体中很多灵芝酸结构近似导致其极性相近，仅靠保留时间无法将相似的灵芝酸区分开来。

因此，对于灵芝菌丝体中灵芝酸的检测，需要开发一种精确的定性定量分析方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时检测灵芝菌丝体中八种灵芝酸的方法，该方法包括如下步骤：

(1)灵芝菌丝体的预处理步骤：将灵芝菌丝体加入有机溶剂进行超声提取，取上清液，过滤，得到的滤液稀释后即为待测样品溶液；配制八个灵芝酸的混合标准品溶液；

(2)超高效液相色谱检测步骤：对待测样品溶液和八个灵芝酸混合标准品溶液进行超高效液相色谱分离，以获得较好的分离度；

(3)化合物质谱信息获得步骤：利用质谱优化软件(Agilent Optimizer)，对八个灵芝酸化合物进行母离子扫描、子离子对的检出以及最佳碰撞能的寻找；