[发明专利]一种双信号输出的病原微生物快速检测方法

说明书

本发明公开了一种双信号输出的病原微生物快速检测方法，该方法利用病原微生物与核酸适配体之间的特异性结合，以及双链DNA特异性核酸酶对两者结合后形成的结构的破坏作用，使得介孔硅纳米材料内的邻苯二胺分子得以释放，释放后的邻苯二胺分子进一步与Ag⁺溶液混合，生成黄色的氧化产物，该产物同时具有荧光信号，且该产物浓度与待测样品中的病原微生物浓度成正比。基于此，通过比色和荧光双信号输出，借助肉眼或便携式荧光分析仪可实现病原微生物的间接定性、定量检测。

技术领域

本发明涉及病原微生物检测技术领域，具体涉及一种双信号输出的病原微生物快速检测方法，尤其涉及一种基于介孔氧化硅纳米材料、核酸酶循环信号放大以及比色和荧光双信号输出的病原微生物快速检测方法。

背景技术

病原微生物包括金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、单增李斯特菌等，是引起食源性疾病的首要原因，其不仅严重影响人们的生命健康，而且影响全球经济的发展。因此，为保障国计民生，在食品或农产品进入市场流通前，非常有必要对微生物种类和含量进行快速筛查与检测。

目前，常见的病原微生物检测方法主要有培养法、PCR法以及ELISA法三大类。其中培养法作为微生物检测的金标方法，尽管结果准确，但通常需要经过分离、鉴定、培养以及计数等环节，操作复杂耗时，一般需要3-5天。而PCR法和ELISA法尽管检测时间大大缩短，但需依赖昂贵的专用仪器以及专业的技术人员，并且对复杂样品难以适用。综上，以上方法均难以满足当前病原微生物现场快速检测的迫切需求。因此，发展一种简单、快速、廉价、准确、高灵敏的病原微生物检测方法，对有效预防和控制食源性疾病的暴发，减轻病原微生物对人类造成的危害意义重大。

近年来，病原微生物的快速检测发展迅速，目前已发展了多种基于电化学、荧光、表面增强拉曼光谱等技术的快速检测方法。然而，上述方法通常是基于单一信号的变化对目标物进行检测。这种单信号输出的方式易受操作人员、实验环境等的影响致使结果不够准确。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种双信号输出的病原微生物快速检测方法，该方法不需要昂贵的仪器和试剂，且可通过比色法和荧光法进行检测，准确性高。

为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：

一种双信号输出的病原微生物快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将介孔硅与邻苯二胺混合，得到介孔中负载有邻苯二胺分子的介孔硅，记为产物A；

S2、采用待测病原微生物的核酸适配体封闭步骤S1所述产物A，得到产物B；

S3、将待测样品、核酸酶以及步骤S2所述产物B置于同一反应体系中，反应后离心取上清液；

S4、将步骤S3所述上清液与Ag⁺溶液混合，通过比色或荧光检测，对病原微生物的浓度进行定性和定量分析；

其中，所述介孔硅为表面修饰了氨基的介孔氧化硅纳米球，其粒径为50-200nm，孔径为2-4nm；所述核酸酶为双链DNA特异性核酸酶。

进一步地，在上述技术方案中，步骤S1所述产物A的制备方法为：将介孔氧化硅纳米球超声分散在Tris-HCl缓冲液中，搅拌条件下，逐滴加入邻苯二胺溶液后，室温振荡反应4-6h，使得邻苯二胺分子充分扩散到介孔氧化硅纳米球的孔中，得到含有产物A的悬浮液；所述邻苯二胺溶液的溶剂为无水乙醇和Tris-HCl缓冲液的混合液；更进一步地，所述无水乙醇与Tris-HCl缓冲液的体积比为1:1，所述邻苯二胺溶液的浓度为10-20mg/mL。