[发明专利]沙蜇触手大、小刺丝囊的分离与毒液提取方法

说明书

本发明提供了沙蜇触手大、小刺丝囊的分离与毒液提取方法，大、小刺丝囊的分离包括沙蛰触手样品的采集、刺丝囊混合物提取、蔗糖溶液非连续密度梯度法初步分离、percoll溶液非连续密度梯度法细分四个步骤，初步分离中，采用80％、70％、50％和20％的蔗糖梯度溶液，细分中采用100％和30％的percoll梯度溶液。一方面，解决了单一的蔗糖溶液分离不彻底而无法精确开展后续大、小刺丝囊活性比较分析的难题；另一方面，由于大、小刺丝囊数量上差异悬殊，科研上所需样品量大，而percoll溶液价格昂贵，因此先采用蔗糖后进一步使用percoll分离也减轻了单一的percoll溶液分离造成的经济上的负担。

技术领域

本发明属于沙蛰大、小刺丝囊的提取分离技术，具体涉及沙蛰大、小刺丝囊的分离方法以及从中提取毒液的方法。

背景技术

刺丝囊是刺胞动物特有的细胞器，大量藏于体表(如触手)、胃腔内面(特别是胃丝和隔膜丝)的上皮中，是水母用于捕食或防御的强大武器，主要包括囊壁、囊内刺丝和感受器三部分，内含大量毒素。当刺丝囊细胞受到外界的物理、化学等刺激时，盘曲的刺丝弹射出来刺入猎物体内，并注入剧毒蛋白质，轻者造成皮肤红肿，痛痒，重者休克，甚至死亡。

水母毒素具有溶血活性、神经毒性、皮肤肌肉毒性，是极具潜力的海洋药物开发资源。刺丝囊具有再生功能，再生时间仅需2天，以此作为水母毒素的采集来源器官，有利于缩短采集周期，实现连续化、工业化生产。

现有技术中，从刺丝囊中提取毒素的大致过程如下：切取水母触手或腕口部组织，低温自溶、离心收集沉淀中的刺丝囊，再通过超声或研磨破碎刺丝囊，离心收集上清经透析后得到毒素粗提物样品。

然而，不同纲的刺胞动物拥有的刺丝囊种类存在差异，且随着刺胞动物在物种上的进化，刺丝囊的成熟性及活性也越来越复杂，单纯提取刺丝囊整体并从中提取毒素的效率和纯度很低。

实际上，电镜下观察发现刺丝囊直径并非均一，而是存在大小差异，能否将不同大小刺丝囊进行区分，不同大小刺丝囊内毒素的活性是否存在差异，尚未有人研究。此外，实验室通常采用percoll溶液非连续密度梯度离心的方法进行整体刺丝囊提取，若将其进一步用于大小刺丝囊分离，需要通过多次密度梯度离心，才可初步实现刺丝囊大小分离，但percoll溶液价格高昂，造成的经济成本非常高，难以在实验室进行普及应用，导致无法开展精确定量的科研实验。

发明内容

本发明是为解决上述问题而进行的，为满足使用水母大、小刺丝囊进行活性比较分析实验的要求，依据刺丝囊直径以及沉降系数差异，对大小刺丝囊先进行分离，然后分别从中提取毒液，并对毒液毒性进行对比。

发明人针对借鉴用于细胞分离的梯度密度离心方法，对不同的密度梯度离心方法进行实验，将其和percoll溶液非连续密度梯度离心的方法联用实现大小刺丝囊分离。通过实验，仅蔗糖密度梯度离心能够实现大、小刺丝囊的初步分离，再联合一步percoll溶液非连续密度梯度离心，实现大、小刺丝囊的细致分离。

本发明的第一方面，提供了一种沙蜇触手大、小刺丝囊的分离方法，包括如下步骤：

S1：沙蛰触手样品的采集

沙蛰水母采集后，剪取其触手的红色部分，收集后保存在-80℃冰箱中。

S2：刺丝囊混合物提取

将沙蜇冷冻触手取出，捣碎后将匀浆液放置于4℃冰箱里，按比例加入4℃预冷的人工海水，搅拌自溶48h后，筛网过滤收集滤液，去掉未自溶的水母组织以及部分杂质，而后于4℃、1,000×g下离心，收集沉淀。

S3：蔗糖溶液非连续密度梯度法初步分离