[发明专利]提高重组大肠杆菌中2’-岩藻糖基乳糖产量的方法

说明书

本发明公开了一种提高重组大肠杆菌中2’‑岩藻糖基乳糖产量的方法，属于基因工程技术领域。本发明采用柔性Linker将四种不同蛋白标签分别融合在α‑1,2‑岩藻糖基转移酶FutC的N端，构建的融合蛋白FP‑futC可以不同程度地提高α‑1,2‑岩藻糖基转移酶催化合成2'‑FL的产量。其中，采用TrxA‑futC融合蛋白合成2'‑FL的产量最高，达到2.94g/L，底物乳糖的消耗达到3.55g/L，乳糖转化率为0.58mol/mol。而在对照组中，不加蛋白标签构建的质粒pMA09‑futC获得的重组大肠杆菌合成2'‑FL的产量仅为1.71g/L，乳糖消耗量为2.88g/L，乳糖转化率仅为0.42mol/mol。进一步将TrxA‑futC融合蛋白基因整合至大肠杆菌MG1655基因组上的yjiP位点，获得一株无质粒的2'‑FL基因工程菌株MG‑26△yjiP::trxA‑futC，摇瓶发酵后2'‑FL的产量达到3.85g/L，乳糖转化率为0.68mol/mol。

技术领域

本发明涉及一种提高重组大肠杆菌中2’-岩藻糖基乳糖产量的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

人乳低聚糖(Human milk oligosaccharides,HMOs)是一类母乳中含量仅次于脂肪和乳糖的新型功能性糖源，可以促进新生儿中有益肠道细菌的生长，增强肠道的屏障功能，对新生儿免疫系统的发育起着重要作用。HMOs具有多种核心单糖结构单元，根据构成HMOs单糖结构单元的不同空间构型、糖基序列、链长等，在糖链的不同位点上进一步岩藻糖化或唾液酸化，可以形成各种结构的HMOs，目前已鉴定出大约200种HMOs分子，其中，以中性岩藻糖基化HMOs为主。2'-岩藻糖基乳糖(2'-FL)是人乳中含量最丰富的一类岩藻糖基低聚糖，已被美国食品和药物管理局(FDA)批准为GRAS级别的HMOs，可作为高档婴配奶粉的营养补充剂，是目前最具商业价值的一种岩藻糖基乳糖。

岩藻糖基转移酶(Fucosyltranferase,FucTs,EC 2.4.1.69)广泛地分布于植物、脊椎动物和细菌中，通常是将岩藻糖从供体底物岩藻糖鸟苷二磷酸(GDP-L-fucose,GDP-L-Fuc)转移至寡糖、糖蛋白和糖脂等糖受体底物上，催化糖缀合物的岩藻糖基化。根据反应过程中形成的不同糖苷键，FucTs可以分成α-1,2-FucT、α-1,3/4-FucT、α-1,6-FucT和O-FucTs四个亚家族。α-1,2-岩藻糖基转移酶(α-1,2-FucT)属于CAZY家族11，催化岩藻糖从供体底物GDP-L-Fuc转移到受体底物，如Galβ1,4Glc NAc或Galβ1,3Glc NAc的半乳糖基上，形成α-1,2-糖苷键。其中，岩藻糖基化的2'-FL是通过α-1,2-岩藻糖基转移酶催化岩藻糖从GDP-L-Fuc转移到底物乳糖的半乳糖基上形成的(图1)。