[发明专利]一种应用于AFP检测的RCQDs纳米探针溶液及其制备方法

说明书

发明提供一种功能化RCQDs纳米探针应用于AFP检测的方法，功能化RCQDs纳米探针的设计与AFP检测原理是：以枇杷叶为前体制备出碳基量子点(RCQDs)，采用猝灭基团BHQ3标记的AFP‑适配体与共价偶联在RCQDs表面的DNA单链杂交结合，由于猝灭基团BHQ3吸收光谱与RCQDs荧光发射大部分重叠，杂交结合在RCQDs表面之后，发生荧光共振能量转移效应(FRET)，RCQDs荧光被猝灭。AFP出现之后，与其适配体特异性杂交发生链置换反应，RCQDs荧光得到恢复。依此来检测AFP含量，该检测方法简单，具有检测的线性范围宽、检测限低及抗干扰等特点，可广泛应用于临床上肝癌标志物的检测。

技术领域

本发明涉及一种利用近红外发射碳基量子点(RCQDs)制备功能化RCQDs 纳米探针的制备方法，应用于甲胎蛋白(AFP)检测技术领域。

背景技术

甲胎蛋白(a-fetoprotein,AFP)是肝癌细胞表达的高特异性蛋白质，分子量约为70KDa，很多肝癌病人(70-80％)在发病期间都有AFP基因高表达的特征，AFP是一种胚原蛋白，其基因在胎儿发育过程开放并表达，而在人出生两年后基本处于关闭状态，正常机体的AFP水平不会超过20ng/mL，但是成人发生肝癌或肝脏良性再生时，AFP的基因重新被激活而大量表达，在临床上被认为是肝癌的经典肿瘤标记物。

适配体是一种能特异性结合靶标分子的单链DNA(ssDNA)或RNA片段，一般可以经体外筛选获得。相比于抗体，适配体具有良好的化学稳定性、较小的分子量、良好的修饰性能和无毒可回收等优点，此外，适配体通常对它们的靶标表现出较高特异性和亲和力,这些优异的优点使它们成为理想的生物传感分子，己被广泛地应用于蛋白质、癌细胞、药物分子、病毒及细菌的分析与检测等生物识别领域中。

最大荧光发射光谱位于650-900nm的近红外发射碳点(RCQDs)，具有较小的辐射能，生物体在这一区间自发荧光很低，活体组织中的血红蛋白、水及脂质等对光波吸收很少，RCQDs在生物组织中穿透深度大，可以在深层组织产生光信号，且对生物体组织几乎不产生任何影响，还可避免背景干扰而获得较高的分析灵敏度，尤其在生物样品检测分析与活体成像等领域中具有明显的优越性。

目前，己报道有许多方法用于AFP的检测，比如酶联免疫分析法、荧光分析法、化学发光法、电化学发光法、电化学法、比色法和表面增强拉曼光谱法等。其中，酶联免疫法和电化学发光法最常用，但这些方法也有一些不足，如灵敏度低、仪器设备昂贵、样品前处理复杂及消耗时间长等，因此，开发一种简单、快速、灵敏的AFP检测方法一直是业界行业的努力方向。

发明内容

为了解决AFP检测灵敏度低、仪器设备昂贵、消耗时间长等问题，本发明的目的在于提供一种简单、快速、灵敏的AFP检测的功能化RCQDs探针溶液。本功能化探针溶液的设计原理是：以枇杷叶为前体制备提取液，经微波法处理，制备出一种氮自掺杂的近红外发射碳基量子点(RCQDs)，所获得的 RCQDs最大发射峰为682nm，量子产率为19.34％，具有良好的水溶性、良好的光稳定性、良好的相容性和较低的毒性。基于RCQDs的优异性能，采用最大吸收波长为672nm的猝灭基团BHQ3标记的AFP-适配体与共价偶联在RCQDs 表面的DNA单链杂交结合，由于猝灭基团BHQ3吸收光谱与RCQDs荧光发射光谱大部分重叠，杂交结合在RCQDs表面之后，RCQDs作为荧光供体，猝灭基团 BHQ3作为荧光受体，发生荧光共振能量转移效应(FRET)，RCQDs荧光被猝灭。 AFP出现之后，与其适配体特异性杂交发生链置换反应，竞争置换出连接在 RCQDs表面的BHQ3-AFP-适配体，使猝灭基团BHQ3远离RCQDs，FRET效应消失，RCQDs荧光得到恢复。

所述功能化RCQDs探针溶液的制备方法包括如下步骤：

步骤一、RCQDs的制备：