[发明专利]一种表征COVID-19康复患者血浆中和抗体活性的间接ELISA检测方法

说明书

本发明公开了一种检表征COVID‑19康复患者血浆中和抗体活性的间接ELISA检测方法，包括以下步骤：(1)使用SARS‑CoV‑2病毒的RBD抗原与N抗原组合包被酶标板，包被后用封闭液进行封闭；(2)将待检测COVID‑19康复患者的血浆稀释后加入步骤(1)处理好的酶标板中孵育；(3)洗板后，加入二抗孵育；(4)孵育后洗板，然后加入显色液显色后检测吸光度值，吸光度值越高表明该待检测COVID‑19康复患者的血浆中和抗体活性越高。使用本申请建立的间接ELISA检测方法不仅可以开展大规模人群的新冠IgG抗体检测和新冠流行病学调查，同时也可以初步筛选潜在的具有高中和抗体滴度的新冠血浆供体，比在BSL3实验室做中和实验更加安全、方便和快速。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种表征COVID-19康复患者血浆中和抗体活性的间接ELISA检测方法。

背景技术

SARS-CoV-2由于传播速度快、传染性强导致全球大流行。截至目前，临床上仍缺乏有效的治疗措施。历史经验证明，在缺乏药物及疫苗的情况下，恢复期血浆(convalescentplasma，CP)疗法也被称为被动免疫疗法可以作为一种治疗选择，并已成功应用于2003年的SARS-CoV和2012年的MERS-CoV两种冠状病毒引发的疾病。CP中含有相应病原微生物的特异性中和抗体(Neutralizing Antibody)，能够与微生物表面的抗原结合，从而阻止该病原微生物黏附靶细胞受体，防止其侵入细胞。

SARS-CoV-2是一种能够感染人的单股正链RNA病毒，冠状病毒科β属，基因组大小约29.9kb，编码刺突糖蛋白(Spick，S)、膜蛋白(Membrane，M)、包膜蛋白(Envelope，E)以及核蛋白(Nucleocapsid，N)4种结构蛋白。刺突蛋白S上的受体结合域RBD通过与血管紧张素转换酶2(Angiotensin-converting enzyme，ACE2)受体结合介导病毒入侵宿主细胞，是刺激机体产生中和抗体的核心抗原。

CP供者信息、有效成分和质量控制以及受者指征是决定治疗效果的关键因素。输注前，CP中抗SARS-CoV-2的中和抗体水平检测尤为重要。目前，病毒中和实验是评估血浆中和抗体滴度唯一有效、准确的方法，但是该方法使用的是真病毒，具有一定的危险性。此外，中和实验需要在BSL-3级生物安全实验室操作，对设备与操作人员要求较高，多数单位无法达到。虽然有研究报道假病毒中和实验可以避免活病毒操作的危险性，但是假病毒中和实验需要细胞培养、制备过表达ACE2细胞系以及细胞转染等一系列繁琐的实验操作，耗时较长。在检测临床血浆中和抗体时，难以实现大规模、快速检测。间接ELISA具有快速、简单和灵敏度高的优点，适合基层单位和医院的大规模筛查。考虑到中和实验的不足，我们尝试建立表征血浆中抗SARS-CoV-2中和抗体的间接ELISA方法。

公开号为CN111337689A的发明专利申请公开了一种新型冠状病毒检测试剂盒，包括底板，以及固定在所述底板上的包被有抗原的胶体金垫、设置有质控线和检测线的NC膜、吸水垫和样品垫，其中，在所述NC膜的检测线端依次固定胶体金垫和样品垫，质控线端固定吸水垫，其特征是在所述胶体金垫上包被的抗原是由胶体金标记的N蛋白和胶体金标记的S-RBD蛋白混合组成的混合抗原蛋白，所述NC膜上设置的检测线为小鼠抗人IgM抗体和小鼠抗人IgG抗体检测线。然而，该现有技术中试剂盒用于检测是否感染新型冠状病毒，是一种定性检测方法，并不能用于表征COVID-19康复患者血浆中和抗体活性，无法实现定量检测CP中IgG抗体水平。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种表征COVID-19康复患者血浆中和抗体活性的间接ELISA检测方法。

一种表征COVID-19康复患者血浆中和抗体活性的间接ELISA检测方法，包括以下步骤：

(1)使用SARS-CoV-2病毒的RBD抗原与N抗原组合包被酶标板，包被后用封闭液进行封闭；