[发明专利]一种利用SpRY-Cas9系统制备CD163基因编辑猪的方法

说明书

本发明公开了一种利用SpRY‑Cas9系统制备CD163基因编辑猪的方法。本发明提供一种制备CD163双等位基因突变细胞的方法，为对猪离体成纤维细胞基因组的CD163基因进行基因编辑，使双等位基因CD163的一条染色体第三外显子的第226‑238位的GTCGAGGGAATGA缺失，另一条染色体第三外显子的第226‑236位的GTCGAGGGAAT缺失，其他核苷酸序列不变，得到CD163双等位基因突变细胞；再用该细胞制备CD163双等位基因敲除猪具有抗PRRSV病毒的能力，表明本发明制备CD163双等位基因敲除猪方法可以得到抗PRRSV病毒的猪。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种利用SpRY-Cas9系统制备CD163基因编辑猪的方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是一种全球性的、传染性强的、危害性大的猪病毒性疾病，其在所有年龄的猪中临床症状不同，但主要是导致妊娠母猪的晚期堕胎、死胎和木乃伊胎以及仔猪的呼吸道疾病，具有较高的死亡率，对全球养猪业造成重大的经济损失，例如在美国，PRRS每年造成的经济损失总额约为6.64亿美元，在欧洲造成15亿欧元的损失，在中国大概造成70亿人民币的损失。

该病于1987年首次在美国爆发，随后于1990-1992年迅速扩散至全球。其病原体是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，此病毒主要有两个类型I和II。PRRSV 是一种单股正义RNA 病毒, 是套式病毒目 (Nidovirales) 、动脉炎病毒科(Arteriviridae)、动脉炎病毒属 (Arterivirus) 的成员,基因组全长15kb，共包含11 个开放阅读框。研究发现PRRSV的唯一天然宿主是猪，可感染猪体内已分化的血液单核细胞和猪肺泡巨噬细胞。Calvert等人通过从猪肺泡巨噬细胞构建的cDNA文库中筛选PRRSV易感的基因而找到了CD163，且CD163只在单核/巨噬细胞系中表达。随后科学家将CD163在一些非易感PRRSV细胞系中进行表达，结果这些细胞系对PRRSV变得易感，而且PPRSV对这些细胞系的感染能力与CD163的表达量呈正相关，表明它是介导PRRSV感染的一种重要受体。