[发明专利]一种用于多种小分子同时检测的亲和素-生物素放大上转换荧光检测方法和试剂盒

权利要求书

1.一种用于多种小分子同时检测的亲和素-生物素放大上转换荧光检测方法，包括以下步骤：

S1.上转换纳米颗粒修饰生物素：将UCNPs-COOH与EDC和NHS混合反应，以实现对羧基的活化，然后，向活化后的UCNPs-COOH分散液中加入Biotin-PEG-NH₂，振荡孵育，得到修饰生物素的上转换纳米颗粒UCNPs-bio；

S2.ABC-UCNPs复合物的制备：将UCNPs-bio与链霉亲和素避光振荡孵育，得到ABC-UCNPs复合物；

S3.包被：将多种小分子的完全抗原包被于黑色96孔板中，并进行封闭处理；

S4.单抗和小分子竞争：将生物素化的多种小分子的单抗和待检测样品加入步骤3)处理后的黑色96孔板中并进行孵育，使待检测样品中的待测小分子和包被的完全抗原竞争结合生物素化的单抗；孵育后进行洗涤；

S5.添加ABC-UCNPs复合物，并避光孵育，孵育后进行洗涤；

S6.读数：采用酶标仪读取荧光值。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法还包括制备标准曲线的步骤：按照S1-S6的方法，检测一系列已知浓度的多种小分子的标准溶液，测得多组荧光值，分别以浓度和荧光值作为横纵坐标作图，得到多种小分子的标准曲线。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤S6还包括：基于标准曲线，计算待检测样品中多种小分子的含量。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述多种小分子为三种抗微生物药：磺胺二甲基嘧啶，沙拉沙星和四环素。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S1包括：取0.8-1.2mg/mL UCNPs-COOH与8-12mg/mL的EDC和8-12mg/mL的NHS混合，在37℃的条件下振荡反应0.5-1.5h以实现对羧基的活化，待反应结束后用缓冲液离心洗涤三次；然后，在活化后的1-3mg/mL的UCNPs-COOH的分散液中加入4-6mg/mL的Biotin-PEG-NH₂，在37℃振荡孵育8-16h；将得到的反应产物即修饰生物素的上转换纳米颗粒UCNPs-bio离心洗涤，再重新分散在PBS缓冲液中，使其终浓度为1-3mg/mL并放置于4℃冰箱备用。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S2包括：首先取1-3mg/mL的UCNPs-bio分散在含0.04％-0.06％Tween-20的PBS缓冲液中超声分散1-5min，再加入1-3mg/mL的链霉亲和素，其中UCNPs-bio与链霉亲和素的体积比为2：2-5；将上述溶液在37℃条件下避光振荡孵育20-40min；得到反应产物ABC-UCNPs复合物，存放于4℃备用。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S3包括：用包被缓冲液将多种小分子的完全抗原按1:3000稀释，按照80-120μL/孔加入黑色96孔板中，置于4℃包被8-16h；将包被的96孔板取出，弃去液体，按160-240μL/孔加入PBST洗涤，重复多次；按照100-150μL/孔加入封闭液并置于37℃孵育0.8-1.2h进行封闭。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S4包括：将生物素化的多种小分子的单抗和待检测样品加入步骤3)的黑色96孔板中并在37℃培养箱中孵育1-3h，使待检测样品中的待测小分子和包被的完全抗原竞争结合生物素化的单抗；孵育后弃去液体，按160-240μL/孔加入PBST洗涤，重复多次。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S5包括：每孔加入80-120μL ABC-UCNPs复合物，在37℃避光孵育20-40min；孵育后弃去液体，按160-240μL/孔加入PBST洗涤，重复多次；

步骤S6中，设置酶标仪的激发波长为808nm，发射波长为545nm。

10.一种用于多种小分子同时检测的亲和素-生物素放大上转换荧光试剂盒，包括以下组分：

(1)生物素修饰的上转换纳米颗粒；

(2)链霉亲和素；

(3)生物素化的多种小分子的单抗；

(4)多种小分子的完全抗原；

其中，组分(1)和(2)可共同以复合物的形式提供；

所述多种小分子优选为三种抗微生物药：磺胺二甲基嘧啶，沙拉沙星和四环素。