[发明专利]一种用于多种小分子同时检测的亲和素-生物素放大上转换荧光检测方法和试剂盒

说明书

本发明属于小分子检测领域，涉及一种用于多种小分子同时检测的亲和素‑生物素放大上转换荧光检测方法和试剂盒。包括以下步骤：S1.将UCNPs‑COOH与EDC和NHS混合反应，然后加入Biotin‑PEG‑NH₂，得到修饰生物素的上转换纳米颗粒UCNPs‑bio；S2.将UCNPs‑bio与链霉亲和素避光振荡孵育，得到ABC‑UCNPs复合物；S3.将多种小分子的完全抗原包被于黑色96孔板中；S4.将生物素化的多种小分子的单抗和待检测样品加入黑色96孔板中并进行孵育，使待检测样品中的待测小分子和包被的完全抗原竞争结合生物素化的单抗；S5.添加ABC‑UCNPs复合物，并避光孵育；S6.采用酶标仪读取荧光值。本发明借助ELISA将UCNPs的荧光优势搭配ABC放大系统实现了对目标物的多靶标高灵敏检测。

技术领域

本发明属于小分子检测领域，具体地，涉及一种用于多种小分子同时检测的亲和素-生物素放大上转换荧光检测方法，以及一种用于多种小分子同时检测的亲和素-生物素放大上转换荧光试剂盒。

背景技术

抗微生物药有助于动物生长，所以经常被添加在动物饲料中进而残留在食物中。随着养殖业的发展，抗微生物药滥用问题尤为凸显。例如，磺胺类、喹诺酮类和四环素类抗微生物药都是常见的食品污染物，通常会同时残留在鸡蛋、牛奶、蜂蜜等食物中协同威胁人体健康。过量的抗微生物药通过食物在人体内蓄积，使人体肠道菌群失调，引起过敏和变态反应，导致细菌耐药性增加，甚至引起各种组织器官癌变。因此，同时检测多种抗微生物药对于环境和食品安全监控的意义重大。

目前，实现同时检测的主要挑战在于简化检测步骤的同时提高灵敏度。酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)是一种十分常见的免疫测定方法，能较好地实现多种目标物的同时检测。相较于大型仪器方法，如HPLC，GC，HPLC-MS联用等，ELISA法操作简单且不需要复杂的前处理过程，常用于食品分析、环境监测和临床诊断。传统的ELISA，借助酶与底物产生颜色反应进行定量测定。目前的ELISA试剂盒已经很成熟且商品化，但它们的灵敏度均有待提高，因此不适用于分析低浓度靶标。很多研究者对ELISA进行改进以提高灵敏度，比如亲和素-生物素复合ELISA(Avidinbiotincomplex-ELISA，ABC-ELISA)和结合等温扩增进行信号放大的ELISA。还有将ELISA与各种荧光分子或纳米材料结合，以荧光作为信号输出，提高检测灵敏度。常见的有量子点、金纳米颗粒、荧光染料等，但这些荧光ELISA仍存在易受光漂白影响、量子产率低、背景值高、荧光寿命不足等局限性。为了解决上述问题，上转换纳米颗粒被考虑作为一个良好的荧光信号输出元件。

发明内容

针对现有技术的上述缺点，本发明要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、稳定性强、操作步骤简便的检测试剂盒和方法，以实现食品中磺胺二甲基嘧啶(SMZ)，沙拉沙星(SAR)和四环素(TC)三种抗微生物药的同时检测。

为了实现上述目的，本发明提供一种用于多种小分子同时检测的亲和素-生物素放大上转换荧光检测方法，包括以下步骤：

S1.上转换纳米颗粒修饰生物素：将UCNPs-COOH与EDC和NHS混合反应，以实现对羧基的活化，然后，向活化后的UCNPs-COOH分散液中加入Biotin-PEG-NH₂，振荡孵育，得到修饰生物素的上转换纳米颗粒UCNPs-bio；

S2.ABC-UCNPs复合物的制备：将UCNPs-bio与链霉亲和素避光振荡孵育，得到ABC-UCNPs复合物；

S3.包被：将多种小分子的完全抗原包被于黑色96孔板中，并进行封闭处理；

S4.单抗和小分子竞争：将生物素化的多种小分子的单抗和待检测样品加入步骤3)处理后的黑色96孔板中并进行孵育，使待检测样品中的待测小分子和包被的完全抗原竞争结合生物素化的单抗；孵育后进行洗涤；