[发明专利]一株高产维生素K2的菌株及其应用

说明书

本发明公开了一株高产维生素K2的菌株及其应用，所述菌株分类命名为Bacillus subtilis ALE‑Gly，保藏编号为GDMCC No：61234。本发明利用含有抑制剂的培养基驯化原始菌株，在含有草甘膦的种子培养基中传代培养，然后在普通种子培养基中恢复培养，获得驯化菌株。驯化后的菌株经发酵，维生素K2产量、生物量、产率分别比原始菌株提高了4倍，2倍，2.4倍左右，同时驯化菌株产芽孢的时间推迟24小时，EPSP合酶的酶活性提高了2‑3倍，且氮源利用率高，发酵时间较原始菌株缩短，降低了生产成本。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株高产维生素K2的菌株及其应用。

背景技术

甲萘醌（Menaquinones，MK），又称维生素K2，是由人体肠道中益生菌菌群产生的微量脂溶性维生素，是一族含有2-甲基-1,4-萘醌环物质的统称，具有叶绿醌生物活性，是人体内必不可少的维生素之一，是一类重要的脂溶性凝血类维生素，其功能主要有①预防和治疗骨质疏松症。②抗动脉钙化及骨关节炎。③抗肿瘤。④延缓衰老⑤修复损伤细胞，潜在的治疗帕金森症药物。其安全性已得到中国食品药品监督管理局、美国药品研究所及欧洲议会和欧盟理事会的权威认定。活性更高的天然甲萘醌仅能通过微生物发酵法获得，因此，微生物发酵法备受国内外学者关注，具有广阔的应用前景。纳豆芽孢杆菌属于枯草芽孢杆菌的亚种，因其安全性、生长速度快、发酵周期短、易于培养和甲萘醌含量高等优势，成为目前发酵制备甲萘醌最主要的微生物，其产物主要为甲萘醌-7（MK-7）。

目前，大部分研究人员主要利用纳豆芽孢杆菌直接发酵产维生素K2或者在枯草芽孢杆菌中构建维生素K2的代谢途径进行生产。关于芽孢杆菌发酵产维生素K2的现有技术主要包括：1.VK2生产菌株的诱变育种；2.关于培养基组成优化。传统的发酵调控过程难以稳定控制，并且发酵调控主要是改变培养基成分或者培养条件，没有从根本上优化菌株的性能。而传统的菌种改造主要通过诱变筛选的方法，但是此方法由于缺乏针对高VK2含量菌种的筛选途径，造成筛选工作的盲目，因此，菌种筛选工作量较大，而筛选效果却往往不够理想。因此，新的菌种性能提升方法，对提高VK2的发酵含量具有重要意义。

发明内容

针对现有方法中，菌种选育过程中相对盲目的技术问题，本技术通过定向驯化的方法获得了一株高产维生素K2的菌株。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

一株高产维生素K2的菌株，其分类命名为Bacillus subtilis ALE-Gly，保藏编号为GDMCC No：61234。

本发明的通过驯化的方法获得维生素K2高产菌株，在驯化培养基中加入化学试剂草甘膦，将纳豆芽孢杆菌培养在含有草甘膦的培养基中驯化，筛选出所述ALE-Gly菌株。

本发明的另一目的在于提供上述菌株在发酵生产VK2中的应用，将所述菌株进行种子培养和发酵培养，获取产物。

进一步的，所述种子培养的方式为：将菌株以1%（V/V）接种量接种至种子培养基活化培养，进行两代活化；

进一步的，每代种子活化的条件为12 h， 37 ℃，200 rpm。

进一步的，种子培养的培养基成分为：葡萄糖30～60 g/L，胰蛋白胨 10～15 g/L，NaCl 5～7 g/L，酵母粉 5～7 g/L。

进一步的，发酵培养的培养基成分为：大豆蛋白胨 60～100 g/L，甘油 30～60 g/L，酵母粉 0.6～0.8 g/L，K₂HPO₄·3H₂O 6.55～8.55 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.3～0.5 g/L，无水CaCl₂ 0.0775～0.0975 g/L。