[发明专利]燕麦糖基转移酶AsUGT73E5及其在甾体皂苷合成中的应用

说明书

本发明涉及皂苷代谢途径，具体涉及燕麦糖基转移酶AsUGT73E5及其在甾体皂苷合成中的应用。本发明提供的糖基转移酶，是如下a1或a2所述的蛋白质：a1.氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质；a2.将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的具有糖基转移酶活性的蛋白质。所述糖基转移酶能够以薯蓣皂苷元、偏诺皂苷元或纽阿替皂苷元为底物，在UDP‑Glc的存在下，产生相应的糖基化产物。

技术领域

本发明涉及皂苷代谢途径，具体涉及燕麦糖基转移酶AsUGT73E5及其在甾体皂苷合成中的应用。

背景技术

重楼是百合科重楼属植物的泛称，可作为云南白药、宫血宁和热毒清等中成药的主要原料，具有极高的药用和经济价值。甾体皂苷是重楼植物的主要化学成分，目前已分离鉴定出 160余种，主要包括重楼皂苷(polyphyllin)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ(薯蓣皂苷类)和Ⅵ、Ⅶ(偏诺皂苷类)，药理活性广泛。抗肿瘤是重楼皂苷的主要作用，重楼皂苷Ⅰ通过抑制人胃癌HGC-27 细胞中PDK1/Akt/mTOR信号通路并下调细胞周期蛋白B1，诱导自噬和细胞周期停滞(Heet al.2019)。重楼皂苷Ⅵ在非小细胞肺癌中通过ROS触发的mTOR信号通路诱导细胞凋亡和自噬(Teng et al.2019)。重楼皂苷Ⅶ能够促进线粒体产生ROS并激活MAPK和PTEN/p53 途径，共同诱导HepG2人肝癌细胞凋亡(Zhang et al.2016)。重楼皂苷Ⅶ在抗菌消炎方面也颇有成效，能显著抑制枝状枝孢菌、念珠菌和痤疮丙酸杆菌的生长，可作为合成药物的有效替代品(Deng et al.2008；Qin et al.2012)。薯蓣皂苷元(diosgenin)能增强高脂血症小鼠的脂蛋白脂肪酶、肝脂酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化酶与一氧化氮合酶的活性，改善脂质分布，起到降血脂的效果(Gong et al.2010)。重楼皂苷Ⅲ具有优异的驱虫活性，可以杀死寄生在金鱼鳃部的指环虫(EC₅₀＝18.06mg l^-1)，且对金鱼低毒(Wang et al.2010)。在新冠肺炎研究中发现，皂苷类分子具有潜在的抗新冠病毒活性。通过对接筛选，推测重楼皂苷Ⅰ可与2019-nCoV主要蛋白酶(M protease)结合，阻止病毒复制(Yan et al.2020)。

现阶段对于重楼皂苷的研究主要集中在医药和临床，导致对其代谢途径，尤其是下游生物合成过程的了解还十分欠缺。2,3-氧化鲨烯(2,3-oxidosqualene)是甾醇和三萜合成的共同前体，在2,3-氧化鲨烯环化酶(2,3-Oxidosqualene cyclases，OSCs)的催化下生成甾醇类或三萜类骨架。多数五环三萜合酶能够催化2,3-氧化鲨烯形成“chair-chair-chair”构象的达玛烷型阳离子，随后经过进一步重排产生α-amyrin、β-amyrin和羽扇豆醇(lupeol)等五环三萜(Xue et al.2018)。环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase)催化2,3-氧化鲨烯形成“chair-boat-chair”构象的前固醇阳离子，继而转化成环阿屯醇，并经一系列反应合成胆固醇。植物中胆固醇的含量虽然普遍较低，但却是植物甾醇(phytosterol)的重要组成部分，亦是甾体皂苷的直接前体(Cárdenas et al.2015)。甾体皂苷元合成需要胆固醇侧链的羟化，主要由细胞色素P450酶 (cytochrome P450 monooxygenase,CYP)参与修饰。例如，在七叶一枝花(Paris polyphylla) 中发现CYP90Bs通过基因复制进化出固醇多羟化酶活性，PpCYP90G4能催化胆固醇C16和 C22位羟化伴随E环闭合。16,22(S)-二羟基胆固醇在PpCYP94D108等酶作用下C26位进一步羟化形成薯蓣皂苷元(Christ etal.2019)，而偏诺皂苷元(pennogenin)C17位P450酶仍待解析。最后，薯蓣皂苷元或偏诺皂苷元在糖基转移酶(UDP-glucosyltransferase,UGT)的作用下发生糖基化，形成具有多种生物活性的重楼皂苷。目前，有关甾体皂苷元糖基化修饰的研究鲜有报道。