[发明专利]CRISPR家族蛋白与核酸的定点偶联方法及其偶联物和用途

权利要求书

1.一种将CRISPR家族蛋白与核酸的定点偶联方法，所述方法包括：

(a)将CRISPR家族蛋白进行非天然氨基酸的定点突变；

(b)将步骤(a)得到的非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白与二苯并环辛炔修饰的核酸进行偶联，从而得到CRISPR家族蛋白与核酸的定点偶联物；

其中，所述的非天然氨基酸为-AeF；

所述CRISPR家族蛋白为SpCas9，在SEQ ID NO.1的第G1367位突变；

或所述CRISPR家族蛋白为AsCas12a，在SEQ ID NO.3的第M806位突变。

2.一种非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白，其中，所述非天然氨基酸为-AeF；

所述CRISPR家族蛋白为SpCas9，在SEQ ID NO.1的第G1367位突变；

或所述CRISPR家族蛋白为AsCas12a，在SEQ ID NO.3的第M806位突变。

3.如权利要求2所述的非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(1)位点选择：根据所述CRISPR家族蛋白的SpCas9或者AsCas12a的结构信息，在所述SpCas9蛋白氨基酸序列中选择第G1367位氨基酸位点，在所述AsCas12a蛋白氨基酸序列中选择第M806位氨基酸位点；

(2)基因突变：将编码步骤(1)中所选择位点的氨基酸的核苷酸利用基因工程方法将突变位点的密码子突变为TAG、TAA或TGA，得到突变的CRISPR蛋白基因；

(3)突变型表达载体构建：将步骤(2)通过基因工程得到的突变的CRISPR蛋白基因通过分子克隆的方式与表达质粒相连接，得到含突变序列的表达载体质粒；

(4)蛋白表达：将(3)得到的表达载体质粒与用于非天然氨基酸插入的工具质粒共同转染到相同的宿主细胞中，在转染成功后的宿主细胞培养液中添加含有所述非天然氨基酸的条件下培养，并诱导宿主细胞表达突变蛋白。

4.如权利要求3所述非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白的制备方法，其中，所述用于非天然氨基酸插入的工具质粒含有tRNA及氨酰-tRNA合成酶，可以特异性识别TAG，并在该密码子对应的位置插入所述非天然氨基酸。

5.如权利要求3所述的非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白的制备方法，其中，在步骤(2)中：将SEQ ID NO.1所示蛋白的第G1367位氨基酸的核苷酸的密码子突变为TAG；或将SEQ ID NO.3所示蛋白的第M806位氨基酸的核苷酸的密码子突变为TAG。

6.用于制备权利要求2所述的非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白的载体，该载体包含编码权利要求2中任一项非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白相应的核酸序列。

7.一种CRISPR家族蛋白与核酸的定点偶联物，其中，所述CRISPR家族蛋白为权利要求2所述的非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白。

8.如权利要求7所述的CRISPR家族蛋白与核酸的定点偶联物，所述核酸可以是oligoDNA、供体DNA、crRNA及其相关修饰核酸。

9.权利要求2所述的非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白、或者权利要求7或8所述CRISPR家族蛋白与核酸的定点偶联物提高基因编辑效率和/或降低脱靶效应的应用。