[发明专利]CRISPR家族蛋白与核酸的定点偶联方法及其偶联物和用途

说明书

本发明公开了CRISPR家族蛋白与核酸的定点偶联方法及其偶联物和用途；所述定点偶联方法包括将CRISPR家族蛋白进行非天然氨基酸的定点突变，然后，再与核酸进行偶联；其中，所述的非天然氨基酸具有正交化学反应活性。本发明定点突变的CRISPR家族蛋白及其偶联物，及其提高基因切割、基因编辑效率及碱基编辑效率等方面的应用。

技术领域

本申请属于但不限于生物医药领域，具体涉及CRISPR家族蛋白与核酸的定点偶联方法及其偶联物和用途。

背景技术

CRISPR是细菌及古细菌中的依赖于RNA的后天免疫防御机制，该机制可以很有效的帮助细菌抵御外界如噬菌体等DNA的侵入，在特定位点高效准确切割外源基因，防止外源基因在体内扩增。细菌利用这种机制阻止病毒的感染，以此实现对自身的保护。SpCas9及AsCas12a分别来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)和氨基酸球菌属(Acidaminococcus BV3L6)，是CRISPR系统的功能行使者。crRNA通过与靶DNA形成碱基配对，将Cas9或者Cas12a引导至靶区附近，并使之构象发生变化，成为具有DNA切割活性的核糖核蛋白复合体(RNP)，活化的Cas9或者Cas12a可以切割靶DNA，使之形成双链缺口(doublestrand break，DSB)。DNA双链缺口对于细胞而言非常致命，因而细胞会快速启动相应的修复机制，主要包括两种修复途径：非同源性末端结合(non-homologous end joining,NHEJ)和同源重组修复(Homologous directed repair，HDR)，前者由于不需要修复模板、响应速度快而被细胞广泛的应用于DNA损伤修复，因而引入缺失或者插入；HDR需要修复模板、且在细胞处于一定分裂周期时才可以启动该修复途径，从而完成DNA双链缺口的精确修复。科学家利用CRISPR系统所产生的DNA双链缺口并在模板DNA的指引下，完成对基因的正确编辑。自该系统被发现以来，因其高效、简捷、稳定的编辑效率，而广泛地被应用于畜牧业及农业的基因改造，有效提高了家畜和经济作物的产量与质量；在医疗健康方面，不仅为人类疾病尤其是遗传病的治愈带来希望，同时其广泛应用也促进了基础科研、基础医学及临床治疗的发展。

随着生物制药技术的发展与更新迭代，蛋白质的随机修饰由于批次生产的不均一性，质量可控性较差等原因逐渐被淘汰，定点修饰的蛋白质药物由于性质均一且可控，已成为现今生物技术制药的研发热点和发展方向。目前常见的蛋白质定点修饰技术主要为以下几类：一、依赖于酶促反应的转肽酶及内含肽技术可实现在蛋白质上特定序列上的定点修饰；二、依赖于糖基化修饰的基于糖基转移酶的定点标记技术，在蛋白上通过融合小蛋白或标签如Aldehyde Tag等实现定点标记；三、依赖于蛋白酶对特定序列的生物素标记。但这些标记均需要特定的序列，因而只能在目的蛋白N/C端添加这种特定序列，对于酶及许多蛋白很容易影响其稳定性和功能，可供选择的空间较小，不适用于对于Cas9及Cas12a的修饰。