[发明专利]一种基于CRISPR-Cas12a的MOF-DNA水凝胶比色检测试剂盒及方法有效
申请号: | 202011254399.8 | 申请日: | 2020-11-11 |
公开(公告)号: | CN112342273B | 公开(公告)日: | 2022-11-15 |
发明(设计)人: | 高志贤;王瑜;彭媛;李双;韩殿鹏;任舒悦;秦康 | 申请(专利权)人: | 军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所 |
主分类号: | C12Q1/682 | 分类号: | C12Q1/682;C12Q1/6825 |
代理公司: | 北京思创大成知识产权代理有限公司 11614 | 代理人: | 高爽 |
地址: | 300050*** | 国省代码: | 天津;12 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 基于 crispr cas12a mof dna 凝胶 比色 检测 试剂盒 方法 | ||
1.一种基于CRISPR-Cas12a的MOF-DNA水凝胶比色检测方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
S1. 制备DNA水凝胶-MOF;
S2. 磁珠识别:将MMPs-APT和过量的互补寡核苷酸cDNA的溶液杂交,得到MMPs-apt-cDNA;磁分离除去未反应的cDNA并重悬;然后,将含有待测小分子的样品溶液与MMPs-apt-cDNA重悬液孵育;随后,通过磁分离收集解离的cDNA;
其中,所述APT为特异性识别待测小分子的适配体核酸序列;所述cDNA为APT的互补核酸序列;
S3. CHA等温扩增:将步骤S2收集的cDNA进行CHA等温扩增,得到等温扩增产物;
S4. 切割步骤:将Cas 12a、crRNA和Cas 12a配套缓冲液孵育,得到Cas 12a-crRNA复合物;然后,加入步骤S1制得的DNA水凝胶-MOF和步骤S3得到的等温扩增产物,继续孵育,得到切割后的水凝胶;
S5. 显色反应:将切割后的水凝胶、H2O2和TMB显色液均匀混合后置于室温下反应,然后加入浓硫酸终止显色,最后通过酶标仪在450 nm波长下进行扫描;
其中,步骤S1包括S1-1和S1-2:
S1-1. 前体Ps-X/Y的合成:将引物X/Y、AA和5×TAE/Mg2+缓冲液混合后在真空条件下放置10-20 min;随后加入0.8-1.2% APS和3-4% N,N,N’,N’-四甲基乙二胺继续在真空条件下放置10-30 min,得到Ps-X/Y;
S1-2. 水凝胶的合成:将Ps-X、Ps-Y、Linker、和MOF在60-70℃共同混合反应3-10 min,然后冷却至20-30℃保持10-30 min,制得所述DNA水凝胶-MOF;
引物X的序列为5’-Acrydite-TTATTCTTGTCTCCCGAGAT-3’(SEQ ID NO:1);
引物Y的序列为5’-Acrydite-TTATTTCACAGATGAGTATC-3’(SEQ ID NO:2);
linker的序列为5’-GATACTCATCTGTGATTATTTTATTTTATTAT CTCGGGAGACAAG-3’(SEQ IDNO:3);
CHA等温扩增所用序列H1、H2的核苷酸序列分别为:
H1:5’-GGCTTCCAGCTTGTTGTTAAGTTTTGTCATATTTACATCAAA ACTTAACAAGAAGC-3’(SEQ IDNO:4);
H2:5’-TTAAGTTTTGATGTAAATATGACAAAACTTAACAAGAAGCT CATATTTACAT-3’(SEQ ID NO:5);
所述crRNA的序列为:5’-GGGUAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAU GUAAAUAUGACAAAACUU-3’(SEQID NO:6);
所述小分子为雌二醇,所述APT的核酸序列为5’-GCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCTCTGCG CATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGCTTTTT-bio-3’(SEQ ID NO:7);所述cDNA的序列为5’-CAAAACTTAACAAGAAGCAGGAA GCC-3’(SEQ ID NO:8);
所述方法用于非疾病诊断目的。
2.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas12a的MOF-DNA水凝胶比色检测方法,其中,该方法还包括制备标准曲线的步骤:按照步骤S1-S5,检测一系列已知浓度的小分子,测得多个显色值,分别以浓度和显色值作为横纵坐标作图,得到标准曲线。
3.根据权利要求2所述的基于CRISPR-Cas12a的MOF-DNA水凝胶比色检测方法,其中,步骤S5还包括:基于标准曲线,计算含有待测小分子的样品溶液中待测小分子的浓度。
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