[发明专利]一种基于CRISPR-Cas12a的MOF-DNA水凝胶比色检测试剂盒及方法

权利要求书

1.一种基于CRISPR-Cas12a的MOF-DNA水凝胶比色检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

S1. 制备DNA水凝胶-MOF；

S2. 磁珠识别：将MMPs-APT和过量的互补寡核苷酸cDNA的溶液杂交，得到MMPs-apt-cDNA；磁分离除去未反应的cDNA并重悬；然后，将含有待测小分子的样品溶液与MMPs-apt-cDNA重悬液孵育；随后，通过磁分离收集解离的cDNA；

其中，所述APT为特异性识别待测小分子的适配体核酸序列；所述cDNA为APT的互补核酸序列；

S3. CHA等温扩增：将步骤S2收集的cDNA进行CHA等温扩增，得到等温扩增产物；

S4. 切割步骤：将Cas 12a、crRNA和Cas 12a配套缓冲液孵育，得到Cas 12a-crRNA复合物；然后，加入步骤S1制得的DNA水凝胶-MOF和步骤S3得到的等温扩增产物，继续孵育，得到切割后的水凝胶；

S5. 显色反应：将切割后的水凝胶、H₂O₂和TMB显色液均匀混合后置于室温下反应，然后加入浓硫酸终止显色，最后通过酶标仪在450 nm波长下进行扫描；

其中，步骤S1包括S1-1和S1-2：

S1-1. 前体Ps-X/Y的合成：将引物X/Y、AA和5×TAE/Mg²⁺缓冲液混合后在真空条件下放置10-20 min；随后加入0.8-1.2% APS和3-4% N,N,N’,N’-四甲基乙二胺继续在真空条件下放置10-30 min，得到Ps-X/Y；

S1-2. 水凝胶的合成：将Ps-X、Ps-Y、Linker、和MOF在60-70℃共同混合反应3-10 min，然后冷却至20-30℃保持10-30 min，制得所述DNA水凝胶-MOF；

引物X的序列为5’-Acrydite-TTATTCTTGTCTCCCGAGAT-3’（SEQ ID NO：1）；

引物Y的序列为5’-Acrydite-TTATTTCACAGATGAGTATC-3’（SEQ ID NO：2）；

linker的序列为5’-GATACTCATCTGTGATTATTTTATTTTATTAT CTCGGGAGACAAG-3’（SEQ IDNO：3）；

CHA等温扩增所用序列H1、H2的核苷酸序列分别为：

H1：5’-GGCTTCCAGCTTGTTGTTAAGTTTTGTCATATTTACATCAAA ACTTAACAAGAAGC-3’（SEQ IDNO：4）；

H2：5’-TTAAGTTTTGATGTAAATATGACAAAACTTAACAAGAAGCT CATATTTACAT-3’（SEQ ID NO：5）；

所述crRNA的序列为：5’-GGGUAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAU GUAAAUAUGACAAAACUU-3’（SEQID NO：6）；

所述小分子为雌二醇，所述APT的核酸序列为5’-GCTTCCAGCTTATTGAATTACACGCAGAGGGTAGCGGCTCTGCG CATTCAATTGCTGCGCGCTGAAGCGCGGAAGCTTTTT-bio-3’（SEQ ID NO：7）；所述cDNA的序列为5’-CAAAACTTAACAAGAAGCAGGAA GCC-3’（SEQ ID NO：8）；

所述方法用于非疾病诊断目的。

2.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas12a的MOF-DNA水凝胶比色检测方法，其中，该方法还包括制备标准曲线的步骤：按照步骤S1-S5，检测一系列已知浓度的小分子，测得多个显色值，分别以浓度和显色值作为横纵坐标作图，得到标准曲线。

3.根据权利要求2所述的基于CRISPR-Cas12a的MOF-DNA水凝胶比色检测方法，其中，步骤S5还包括：基于标准曲线，计算含有待测小分子的样品溶液中待测小分子的浓度。