[发明专利]一种基于CRISPR-Cas12a的MOF-DNA水凝胶比色检测试剂盒及方法

说明书

本发明属于生物检测领域，涉及一种基于CRISPR‑Cas12a的MOF‑DNA水凝胶比色检测试剂盒及方法。该方法包括以下步骤：S1.制备DNA水凝胶‑MOF；S2.将MMPs‑APT和互补寡核苷酸cDNA的溶液杂交，得到MMPs‑apt‑cDNA；磁分离除去未反应的cDNA并重悬；将样品溶液与MMPs‑apt‑cDNA重悬液孵育；通过磁分离收集解离的cDNA；S3.将cDNA进行CHA等温扩增；S4.将Cas 12a、crRNA和Cas 12a配套缓冲液孵育，加入DNA水凝胶‑MOF和等温扩增产物，得到切割后的水凝胶；S5.将切割后的水凝胶进行显色并检测。本发明突破了基于CRISPR‑Cas12a的传感器都只用于核酸检测的限制，将其结合DNA水凝胶，成功应用于雌二醇小分子目标物的检测。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体地，涉及一种基于CRISPR-Cas12a的MOF-DNA水凝胶比色检测小分子的试剂盒，以及一种基于CRISPR-Cas12a的MOF-DNA水凝胶比色检测小分子的方法。

背景技术

雌二醇(estradiol，E2)，亦称“动情素”、“求偶素”。由卵巢内卵泡的颗粒细胞分泌。其代谢物是雌酮及雌三醇。其靶器官为子宫、阴道、输卵管和垂体。作为常见的雌激素会干扰人体内分泌，危害人体健康。由于类固醇生长激素的滥用，E2广泛存在于肉类、乳制品等商品中。动物体内的激素作为一种典型的环境内分泌干扰物被排泄到环境中。E2具有不可降解性、长残留期和亲脂性等特点，可通过食物链的放大作用和生物富集作用被吸收到体内。它可以干扰生物体内自体激素的活动，对生物体的生殖、神经和免疫系统产生负面影响，破坏生态平衡。

在食品安全和临床诊断等领域，对高灵敏和具有时效性的精准检测方法的需求仍在持续增长。随着检测手段的多元化和纳米材料的发展，目前已经涌现了许多灵敏快速的检测方法。但是它们可能较难同时满足高灵敏，特异性，准确性和速度的要求。近期得到飞速发展的簇状规则间隔短回文重复序列及相关蛋白(CRISPR-CAS系统)，不仅给基因组编辑带来了福音，而且也给检测传感领域带来了翻天覆地的的变化。张锋，James J.Collin等研究人员利用CRISPR-CAS系统的切割特性构建了多种核酸检测传感器。其中，CRISPR-Cas12a(Cpf1)是一种与CrRNA结合的Ⅱ型CRISPR-Cas12a(Cpf1)。Cas12a一旦被目标DNA激活，它就会不分青红皂白地疯狂切割体系中的ssDNA。CRISPR-Cas12a系统在核酸检测领域中具有易操作、高灵敏(检测限可达埃摩尔浓度)、高特异性等优点。然而，目前Cas12a在疾病诊断、食品质量和环境控制等领域中结合纳米材料的高灵敏检测非核酸靶标的应用鲜少被报道。

因此，有必要开发一种高灵敏度的检测方法，对食品中雌二醇含量进行监测。

发明内容

针对现有技术的缺点，本发明要解决的技术问题是提供一种基于CRISPR-Cas12a的MOF-DNA水凝胶比色方法，以实现食品中雌二醇的快速现场筛查。

为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种基于CRISPR-Cas12a的MOF-DNA水凝胶比色检测小分子的方法，该方法包括以下步骤：

S1.制备DNA水凝胶-MOF；

S2.磁珠识别：将MMPs-APT和过量的互补寡核苷酸cDNA的溶液杂交，得到MMPs-apt-cDNA；磁分离除去未反应的cDNA并重悬；然后，将含有待测小分子的样品溶液与MMPs-apt-cDNA重悬液孵育；随后，通过磁分离收集解离的cDNA；

其中，所述APT为特异性识别待测小分子的适配体核酸序列；所述cDNA为APT的互补核酸序列；

S3.CHA等温扩增：将步骤S2收集的cDNA进行CHA等温扩增，得到等温扩增产物；