[发明专利]一种用于检测CALR基因突变的试剂和试剂盒

说明书

本申请公开了一种用于检测CALR基因突变的试剂和试剂盒。本申请试剂包括CALR基因特异性引物对和探针，及CLAMP核酸序列；特异性引物对能特异扩增包含突变区域的CALR基因；CLAMP核酸序列为仅与CALR野生型基因完全互补的3’端磷酸化单链，CLAMP核酸序列互补结合于CALR基因其中一条DNA链，且其互补结合区域覆盖特异性引物对中一条引物的3’端，并覆突变区域；CLAMP核酸序列、特异性探针和被CLAMP核酸序列覆盖的引物，结合于CALR基因相同DNA链上。本申请试剂，通过引物和CLAMP核酸序列竞争，抑制野生型基因扩增，从而提高CALR基因突变检测的灵敏度，降低假阴性率，提高检出率。

技术领域

本申请涉及基因突变检测领域，具体涉及一种用于检测CALR基因突变的 试剂和试剂盒。

背景技术

骨髓增殖肿瘤(myeloproliferative meoplasm，MPN)是一组起源于多功能 造血干细胞的恶性肿瘤，其特征为一系或多系骨髓造血细胞异常克隆性增殖， 包括真性红细胞增多症(polycythemia，PV)、原发性血小板增多症(essential thrombocthemia,ET)、原发性骨髓纤维化(primary myelofibrosis,PMF)。

研究表明，97％的PV，50％-60％ET及PMF患者中有JAK2 V617F基因突 变，MPL515基因突变可见于3％-5％的携带野生型JAK2 V617F基因的ET及 PMF患者，然而，仍有约35％-40％的ET与PMF患者未检测到JAK2 V614F基 因和MPL515基因的异常。近年来，有研究指出，约70％-80％的携带野生型JAK2 基因和野生型MPL基因的ET与PMF患者中存在CALR基因(钙网蛋白基因) 突变，通过联合检测JAK2、MPL和CALR基因突变，ET与PMF确诊阳性率 可达97％。

CALR是一种主要位于内质网的有多重功能的钙离子结合和储存蛋白分子 伴侣，通过协助蛋白质正确折叠和维持细胞钙离子稳态而参与调节细胞增殖、 凋亡、黏附、免疫等过程。CALR基因定位于染色体19p13.2，它有9个外显子 和9个蛋白结构域，CALR基因突变是由第九外显子插入和缺失引起，导致一个 碱基对的读码框移位，继而产生一种具有缺乏内质网保留序列(KDEL氨基酸序 列)的新型的C-羧基末端的蛋白。到目前为止，已经检测到多于40种不同的 CALR突变体。

CALR基因的突变检测普遍采用基因测序的方法，但是测序方法价格昂贵， 过程复杂，耗时时间长，不利于临床快速诊断。此外，也有研究利用多克隆抗 体，通过ET与PMF患者骨髓活检标本的免疫染色来区别CALR突变的患者， 此方法快速简单、成本低廉，但是此种染色标记主要定位于活体巨核细胞，对 样本保存要求较高，不适用于单独检测使用。

荧光定量PCR方法，可针对CALR基因的特定位点进行引物探针的设计， 灵敏度高、特异性强，且整个体系完成检测仅需2-3个小时，检测样本为提取后 的CALR核酸样本，易于保存，操作简单易行。然而，对于大量野生型CALR 基因中混合少量突变型的情况，当野生型基因和突变型基因存在交叉反应时， 采用普通的荧光PCR方法检测突变型CALR基因，存在灵敏度低、假阴性率高、 以及检出率低的问题。

发明内容

本申请的目的是提供一种用于检测CALR基因突变的试剂，以及用于检测 CALR基因突变的试剂盒。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请的第一方面公开了一种用于检测CALR基因突变的试剂，包括：用 于实时荧光PCR检测CALR基因的特异性引物对和特异性探针，以及CLAMP 核酸序列；

特异性引物对能够特异性的扩增CALR基因，并且，扩增靶标片段包含 CALR基因的突变区域；