[发明专利]神经母细胞miR-200b/c高表达的慢病毒表达载体及其构建方法

权利要求书

1.一种神经母细胞miR-200b/c高表达的慢病毒表达载体，其特征在于，包括：PCDH-copGFP载体及miR200b/c基因序列，所述miR200b/c基因序列酶切插入PCDH-copGFP载体中得到miR200b/c高表达的慢病毒表达载体，所述PCDH-copGFP载体和miR200b/c的前体DNA序列均包含BamHl和EcoRI两个酶切位点。

2.根据权利要求1所述的神经母细胞miR-200b/c高表达的慢病毒表达载体，其特征在于，所述miR200b/c基因序列为前体pre-miRNA；

miR200b的基因系列位置156055681—156055750，其长度为511bp，序列如下：

catctaatttccaaaagagaacttgatcttacttcaagctgttgacctctccactacctatctttggagatgagaatgcagggctttctgctgttgtcctgaaggggtgccctccttctgcaatgctctggggattaggacacttaggcatctgggccctgcccatggaatctagtcatcttcaactccctgctaggcggcctccatatccaacttgggcagccgtggccatcttactgggcagcattggatagtgtctgatctctaatactgcctggtaatgatgacggcggagccctgcatgcagcaatggagccgcctcctgatcccagcctccaggggccccagttccacacctcacctaccttatccaaggtagggctatggggcaaagagttagccttggcgatatgggtggtgggaggctttagggagagttcccccaaaccaggcacctctgagggccactctatatcctggggtgagaggctcctcccattgccctg ggggc；

miR200c的基因系列位置124718322-124718390，其长度为501bp，序列如下：

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3.一种神经母细胞miR-200b/c高表达的慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，包括：

在基因数据库mirbase上查找包含miR200b/c前体的基因序列；

通过PCR扩增得到miR200b/c前体的基因片段；

将PCDH-copGFP载体及miR200b/c前体的基因片段进行双酶切处理，得到酶切产物；

对所述酶切产物进行纯化处理，并利用T4连接酶将miR200b/c的基因片段与PCDH—copGFP载体进行连接得到连接物；

取所述连接物转化E.coli DH5α感受态细菌，并置于LB培养基中培养并抽其质粒；

挑取阳性质粒并用BamHI和EcoRI双酶切鉴定，并进行测序分析，以确定慢病毒表达载体构建成功。