[发明专利]一种提高中心记忆T细胞比例的T细胞制备技术

权利要求书

1.一种提高中心记忆T细胞比例的T细胞制备技术，其特征在于，包括以下步骤：

S1、外周血单个核细胞的分离；

S2、T细胞的扩增；

S3、T细胞的检测。

2.如权利要求1所述的T细胞制备技术，其特征在于，步骤S1所述的单个核细胞分离过程为：于无菌条件下采集外周血50mL，将血液标本送至实验室，进行外周血单个核细胞的分离，将血液与摩尔浓度为0.01mol/L的PBS缓冲液按1:1比例稀释，吹打混合均匀，利用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，将细胞沉淀用含10％HPL的T细胞无血清培养基重悬，制得外周血单个核细胞悬液。

3.如权利要求2所述的T细胞制备技术，其特征在于，所述外周血添加抗凝剂ACD-A，外周血与ACD-A的体积比为20ml：3.5mL；所述淋巴细胞分离液可购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，货号为LTS10771。

4.如权利要求2所述的T细胞制备技术，其特征在于，所述HPL的提取方法为：将采集的外周血按20:3.5的体积比与ACD-A抗凝剂混合，按200g-400g离心力，离心10min，离心后混合物分为三层：上层为贫血小板血浆，中层为浓缩的血小板，下层为红细胞，吸取上层、中层悬液，转移至新的离心管，于200g-400g下离心10min，离心后混合物分为三层：上层为贫血小板血浆，中层为高度浓缩的血小板，下层为红细胞，收集中层高度浓缩的血小板，置于-80℃冰箱中24h后取出，置于37℃水浴锅中直至融化，再次重复上述冻融操作，以充分裂解血小板，将上述裂解后的血小板于4℃，4000rpm下，离心15min，吸取上层血小板裂解产物，用0.22μm过滤器过滤后分装，于-20℃保存。

5.如权利要求2所述的T细胞制备技术，其特征在于，所述T细胞无血清培养基可购自TAKARA生物公司，货号为SK551S。

6.如权利要求1所述的T细胞制备技术，其特征在于，步骤S2所述的扩增过程为：向制得的外周血单个核细胞悬液中，添加CD3/CD28抗体偶联磁珠激活T细胞，在上述培养体系中添加重组人IL-2使其终浓度为300IU/mL-500IU/mL，同时添加重组人IL-7与重组人IL-15使其终浓度均为5ng/mL-8ng/mL，将细胞置于培养箱中培养。

7.如权利要求6所述的T细胞制备技术，其特征在于，所述CD3/CD28抗体偶联磁珠与外周血单个核细胞的比例为1：1-3：1。

8.如权利要求6所述的T细胞制备技术，其特征在于，所述培养箱中的培养条件为37℃、5％的CO₂浓度，培养时间为14天，根据细胞生长增殖情况补充培养液。

9.如权利要求1所述的T细胞制备技术，其特征在于，步骤S3所述的检测过程为：将T细胞悬液收集后，于1000rpm下离心10min，去上清，细胞沉淀用4℃预冷的0.01mol/L的PBS缓冲液洗涤2次，每次以1000rpm离心10min，用200μL PBS缓冲液重悬细胞沉淀，取1×10⁶个细胞用0.1mL预冷的0.01mol/L PBS重悬，避光加入相应荧光抗体，4℃避光孵育30min，加入2mL PBS，l000rpm离心l0min，洗涤细胞以除去未结合的抗体，去上清，细胞沉淀用PBS液重悬，上流式细胞仪检测。

10.如权利要求9所述的T细胞制备技术，其特征在于，所述荧光抗体包括CD4Antibody-FITC，CD8 Antibody-PE，CD197(CCR7)Antibody-PerCP，CD45RO Antibody-APC，CD3 Antibody-APC，CD62L Antibody-FITC，CD56 Antibody-PerCP。